Teknik dan Uji #2: Ekstraksi DNA

Dalam studi bioteknologi, metode ekstraksi DNA adalah metode yang pertama kali dikenalkan kepada mahasiswa. Metode ini adalah metode umum yang digunakan untuk mendapatkan DNA dari organisme seperti tumbuhan.

Organisme contoh yang akan saya bahas untuk teknik ini adalah bawang bombay. Tumbuhan ini juga yang umumnya digunakan mahasiswa bioteknologi untuk belajar mengekstraksi DNA untuk pertama kalinya.

Apa itu DNA
Deoxyribonucleic acid atau DNA adalah materi genetik yang memuat instruksi untuk pembentukan dan perkembangan sel. Seperti blueprint, DNA menentukan bagaimana suatu organisme memiliki sel, sifat, dan perilaku tertentu yang membuat dirinya berbeda atau mirip dengan organisme lain. DNA juga berperan dalam penggandaan sel, pembentukan sel gamet, dan pembentukan protein.

Untuk mengetahui bagaimana suatu organisme memiliki kesamaan nenek moyang, atau bagaimana virus dan bakteri penyakit tertentu dapat dideteksi, kita perlu mengambil DNA dari suatu sel makhluk hidup.

DNA tersusun dari nukleotida yang terdiri dari fosfat, gula pentosa, dan basa nitrogen. Nukleotida akan berikatan dengan nukleotida yang lain dalam ikatan fosfat yang membentuk satu rantai polinukleotida (satu untai DNA). DNA yang umumnya kita lihat dalam film atau buku adalah dua rantai polinukleotida yang tersusun double helix oleh ikatanan hidrogen antar basa nitrogen. 

DNA sangat panjang sehingga untuk dapat dimuat dalam satu sel, DNA harus dikemas. Untaian DNA berikatan dalam protein histon, yang kemudian dikemas dalam bentuk kromatin atau kromosom. 

Pada sel tumbuhan dan sel hewan, DNA suatu sel disimpan dalam nukleus. Pada sel tumbuhan, sel memiliki dinding sel.  

A. Ekstraksi DNA Sel Tumbuhan 
Metode ekstraksi DNA sel tumbuhan dan hewan dibandingkan dengan sel mikroorganisme memiliki sedikit perbedaan. Sekarang saya bahas dulu metode ekstraksi DNA dari sel tumbuhan, yang biasanya paling umum dipelajari.

Ada tiga tahap dalam ekstraksi DNA:
1. Merusak Sel 
Pertama, bawang bombay dipotong-potong hingga berukuran kecil dan dihaluskan dengan mortar dan alu hingga halus.... 

Sel memiliki pelindung yang harus dihancurkan. Pada tahap ini dinding sel dihancurkan dengan cara digerus dengan mortar dan alu. Dengan cara ini diharapkan sel pecah dan mengeluarkan organel, sitoplasma, dan nukleus (yang memiliki DNA).

2. Merusak membran sel 
...Sampel yang halus dimasukan larutan garam dan divorteks. Campuran dimasukkan deterjen dan divorteks kembali. Selanjutnya, campuran diinkubasi pada suhu 65C selama 15 menit dalam waterbath. Setelah didinginkan hingga suhu ruang, meat tenderizer dimasukkan ke dalam campuran dan diinkubasi selama 5 menit. Campuran disentrifugasi dan supernatan diambil ke dalam microtube baru...

Garam 

1. Garam (NaCl) berperan sebagai pelarut DNA. Ion Na+ akan berikatan dengan kutub negatif fosfat DNA sehingga DNA akan berkumpul. 
2. Melakukan presipitasi karbohidrat dan protein. 
3. Menyebabkan perubahan osmosis yang menyebabkan sel lisis (pecah).
4. Selain sebagai pemekat DNA, garam berfungsi menjaga kestabilan pH.

Deterjen 

1. Deterjen memiliki bagian hidrofobik yang berikatan dengan membran sel (pada molekul protein dan lemak). Bagian hidrofilik dan hidrofobik deterjen membantu melarukan lapisan fosfolipid bilayer membran sel. 
2. Mengurangi aktivitas enzim nuklease yang dapat mendegradasi DNA. 
3. Mengandung EDTA yang berperan mengkhelat ion logam yang meningkatkan aktifitas enzim DNAse dan RNAse. 

Suhu panas 
Suhu tinggi menyebabkan denaturasi protein dengan memutuskan ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik nonpolar.

Meat tenderizer 

1. Merupakan protease yang memecah protein histon, sehingga DNA terurai. 
2. Protease juga dapat memecah DNAse yang dapat mendegradasi DNA. 

3. Presipitasi DNA 
...Etanol 96% dimasukkan ke dalam microtube. Microtube dikocok secara perlahan dan diinkubasi pada suhu -30C selama 30 menit. Awan yang terbentuk adalah DNA yang terpresipitasi. Pisahkan dari supernatan dengan disentrifugasi. Supernatan dibuang hingga menyisakan pelet di dalam microtube. Keringkan dan larutkan pelet dengan buffer TE. 

Etanol 96% dingin

1. Pada saat alkohol dituang, alkohol memiliki kerapatan larutan yang lebih rendah daripada campuran sehingga berada pada lapisan atas campuran. Alkohol berperan dalam presipitasi DNA, menyebabkan molekul DNA tidak larut dan muncul dalam bentuk awal spiral. 
2. Etanol juga berperan menghambat kerja enzim DNAse, enzim yang mendegradasi DNA menyebabkan DNA tidak dapat dianalisis dengan elektroforesis.   

Hasil presipitasi etanol
sumber: dokumen pribadi 

Buffer 
Buffer berfungsi untuk menjaga struktur DNA agar tidak mengalami perubahan molekul, menjaga DNA dari enzim pendegradasi DNA.

Ekstraksi DNA Mikroorganisme 
Tahap pertama adalah memperoleh sel mikroorganisme dari kultur. Kultur mikroorganisme di dalam microtube disentrifugasi pada kecepatan 11.000 rpm selama 1 menit (kecepatan dan lama waktu bisa bervariasi tergantung metode dan referensi yang digunakan). Sentrifugasi akan menghasilkan supernatan (mengandung medium cair) dan pelet (mengandung sel mikroba). Supernatan dibuang. Sentrifugasi dilakukan sekitar tiga kali untuk memperoleh sel mikroba yang banyak.

DNA dapat diekstraksi dari pelet menggunakan metode yang sudah dibahas sebelumnya. Namun, metode ekstraksi konvensional ini mungkin saja tidak menghasilkan DNA terutama untuk bakteri Gram-positif dan yeast. 

Bakteri Gram-positif memiliki peptidoglikan yang membuatnya memiliki dinding sel lebih tebal daripada bakteri Gram-negatif sehingga lebih sulit lisis. Dinding sel bakteri dapat dilisiskan dengan cara:

1. Pemanasan sebelum pemasukan larutan garam. 
2. Penambahan lysozyme dan mutanolysin ke dalam sample sebelum dimasukkan deterjen. 
3. Proses pembekuan dan pengenceran berulang dalam buffer lisis sebelum ditambah etanol.  

Metode konvensional ini cocok dilakukan di lab kampus atau lab sederhana. Pastikan selama melakukan metode ini, alat yang digunakan sudah disterilkan, menggunakan sarung tangan dan masker, serta menggunakan teknik aseptik (dengan etanol 96%).

Bagaimana menyimpan DNA?
1. Menghambat DNAse menggunakan buffer dan inkubasi pada suhu -30ºC
2. Menyimpan DNA pada suhu -50ºC sampai -80ºC.
3. Menggunakan EDTA yang mengkhelat logam pengaktif enzim.

Semoga artikel ini membantumu :)

Referensi 
Aitken, A. 2012. TE Buffer (Tris-EDTA Buffer). Retrieved from Natural History Museum:http://www.nhm.ac.uk/resources-rx/files/te-buffer_aug12-11864 8.pdf (6 September 2015).

Caplan, G. M. 2001. DNA Extraction Lab. Retrieved from Owensboro Community & Technical College: http://legacy.owensboro.kctcs.edu/gcaplan/science/1.%20dna_extraction_lab.htm (8 Setpember 2015). 

Harju, S., Fedosyuk, H. & Peterson, K. R. 2004. Rapid isolation of yeast genomic DNA: Bust n' Grab, Bio Med Biotechnology, 4: 8. 

Melo, S. C. O., Pungartnik, C., Cascardo, J. C. M. & Brendel, M. 2006. Rapid and efficient protocol for DNA extraction and molecular identification of the basidiomycete Crinipellis perniciosa. Genetics and Molecular Research, 5: 851 - 855. 

Plant and Soil Science. 2014. DNA and DNA Extraction. Retrieved from Plant & Soil Sciences: http://passel.unl.edu/pages/informationmodule.php?idinformationmodule=957882007&topicorder=6&maxto=7 (5 September 2015).

Rice, G. 2015. DNA Extraction. Retrieved from Microbial Life Educational Resource: https//serc.carleton.edu/microbelife/search_methods/genomics/dnaext.html (8 September 2015).

Ulrich, R. L. & Hughes, T. A. 2001. A. rapid procedure for isolating chromosomal DNA from Lactobacillus species and other Gram-positive bacteria. Letters In Applied Microbiology, 32: 52 - 56. 

University of Utah. 2015. Why Am I Adding Detergent. Retrieved from Learn Genetics University of Utah: http://learn.genetic.utah.edu/content/lab/extraction/howto/detergent/ (8 September 2015). 

University of Utah. 2015. Why Did I Add Tenderizer. Retrieved from University of Utah: http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/howto/enzyme/ (8 September 2015). 

University of Washington. 2006. DNA Isolation from Strawberries. Retrieved from University of Washington: http:// www.gs.washington.edu/outreach/dhillon_dnaprocedure.pdf (5 September 2015).

Special thanks:
A. Admadja
D. Rizkinata
V. Ganda
A. T. Sugianto
D. Andrian
F. M. Eddy
M. N. Setiadi
Y. Laurensia