Teknik dan Uji #1: Teknik Plating dan Aseptik

Artikel ini adalah kelanjutan dari Instrumen #1: Petri Dish dan Medium yang khusus membahas teknik yang melibatkan Petri Dish dan Medium. Teknik ini diperlukan dalam penelitian mikrobiologi.

Lihat lagi artikel mengenai bioteknologi (klik judul)

Sebelumnya kita bahas dulu bagaimana menyiapkan medium kosong dalam Petri Dish

Petri dish: Bungkus dengan kertas bekas. Jika kertas ada tinta cetak, pastikan halaman tersebut berada di bagian luar bungkusan. Pastikan semua bagian Petri dish tertutup. Selotip beberapa bagian yang dirasa mudah lepas. Masukan dalam mesin autoklaf dan sterilkan. 

Medium: Medium tergantung dari jumlahnya dapat disimpan di botol Duran, Erlenmeyer, atau tabung kultur. Namun jangan menyiapkan medium di dalam Petri dish. Panas autoklaf melelehkan medium yang akan membasahi semua bungkusan Petri dish (dan bukan seperti itu juga langkahnya). 

Larutkan medium sesuai keperluan volume yang dibutuhkan. Lihat pada kemasan untuk konsentrasi yang dianjurkan. Dari nilai konsentrasi itu, gunakan perbandingan (atau rumus: M x V = M x V) untuk menentukan berat bubuk medium yang digunakan. Simpan bubuk dalam suatu wadah/botol dan larutkan dengan akuades. 

Medium dipanaskan untuk melarutkan agar. Pemanasan dapat dilakukan dengan microwave atau hot plate. Keadaan wadah boleh dalam keadaan tertutup atau tidak, tetapi ada dua hal yang harus dipertimbangkan: 

1. Jika menggunakan tutup (tutup Duran atau aluminium foil + plastic wrap), longgarkan tutup. Perhatikan baik-baik medium selama proses pemanasan. Tekanan dari uap air yang panas dapat membuat tutup lepas dan medium tumpah kemana-mana. Jika tumpah, harus segera dibersihkan. Percaya lah, aroma medium adalah bau terakhir yang ingin kamu cium di lab, ke depannya kamu gak akan doyan terasi. 
2. Jika tidak menggunakan tutup. Pemanasan tetap harus diperhatikan karena air yang panas dapat lolos sebagai uap air. Hal ini akan menurunkan volume air yang ditambahkan (mengubah konsentrasi yang diharapkan).

Setelah medium dipanaskan, tutup rapat. Untuk botol duran dan tabung kultur, tidak perlu ditutup sangat rapat. Hal ini untuk mencegah wadah meledak karena tekanan uap air. Setelah ditutup masukan ke dalam autoklaf dan sterilisasi.

autoklaf
sumber: http://annanyo22.blogspot.com

Medium + Petri Dish: Lakukan di dalam Laminar Air Flow Cabinet 

Laminar air flow
sumber: indiamart.com

1. Lakukan prosedur penggunaan LAF.
2.  Masukkan Petri dish dan medium setelah disemprot dengan alkohol 70%. Nyalakan sinar UV dan tunggu sekitar 15 menit. Setelah itu, lap meja kerja dengan alkohol. 
3. Buka pembungkus Petri dish dan botol medium. Panaskan sisi-sisi Petri dish dan ujung botol sebelum menuang medium ke dalam Petri dish. Ingat jangan terlalu banyak dan jangan terlalu sedikit. 
4. Dalam keadaan tutup Petri dish  setengah terbuka, keringkan medium di dalam LAF dalam keadaan turbin angin aktif dan sinar UV menyala.
5. Pada saat medium sudah mengeras, tutup Petri dish, panaskan kembali sisi-sisinya, dan segel dengan plastic wrap. Beri label jika perlu. Utamanya label meliputi nama sampel, tanggal pembuatan, dan nama peneliti (optional). 
6. Jika masih ada medium tersisa, panaskan pinggir mulut botol dan tutup. 
7. Matikan bunsen, cek turbin angin sudah dimatikan atau belum. Keluarkan semua barang dan semprot kembali dengan alkohol jika perlu.
8. Bersihkan meja LAF dengan alkohol dan tissu. Nyalakan sinar UV selama 15 menit. 

sumber: https://www.foodnavigator.com/

Prosedur ini dilakukan untuk menyiapkan medium kosong dalam Petri dish. Beberapa langkah akan berbeda tergantung metode dan keperlukan penelitian yang dilakukan. Artikel ini masih ada kelanjutannya: membahas teknik plating dan teknik aseptik.

Berapa jumlah medium yang dimasukkan ke dalam satu petri? 

Nah ini tergantung dari ukuran Petri dish yang digunakan. Umumnya 12 ml sudah cukup. Ada juga yang membuat medium sebanyak 10 ml hingga 20 ml per Petri dish, tapi 20 ml sudha terlalu banyak sih. 

Perlu diingat:

Jika terlalu banyak, medium akan kontak dengan penutup Petri dish dan tidak memberikan area yang cukup untuk mikroba bertumbuh. Jika medium terlalu sedikit, medium tidak dapat melapisi dasar Petri dish dan agar menjadi cepat kering. Medium yang terlalu sedikit juga tidak cocok untuk metode well diffusion pada uji antimikroba karena sampel menjadi mudah tumpah. 

Menyiapkan medium cair dalam tabung kultur

Umumnya volume medium cair yang digunakan adalah 5 ml atau 10 ml, tetapi tergantung lagi pada tinggi dan volume kapasitas tabung kultur, juga penelitian yang dilakukan.

1. Hitung berat medium bubuk. Medium cair tidak memerlukan agar dan biasanya pada kemasaan akan ada tulisan "broth". Larutkan bubuk medium dalam sebuah wadah seperti Erlenmeyer. 
2. Lakukan pemanasan seperti yang dideskripsikan sebelumnya. 
3. Kemudian pindahkan medium yang telah dipanaskan ke tabung kultur menggunakan pipet ukur. Cara ini jauh lebih mudah daripada harus memasukan bubuk medium satu persatu ke dalam semua tabung kultur. 
4. Tutup tabung kultur dengan aluminium foil + plastic wrap, atau tutup kultur. Jika menggunakan tutup kultur, jangan menutup terlalu kencang, longgarkan sedikit. 

Teknik Aseptik 

Inokulasi adalah proses menumbuhkan mikroorganisme yang diambil dari medium lama ke medium baru. Digunakan untuk mencegah kontaminasi mikroorganisme luar yang akan mengganggu pertumbuhan mikroorganisme kita. Bahan dan alat yang diperlukan adalah:

1. Sarung tangan 
2. Semprotan alkohol 70% 
3. Tissue 
4. Mikropipet
5. Pipet tips (sudah diautoklaf) 
6. Loop
7. Bunsen 
8. Plastic wrap 
9. Petri dish dengan medium kosong 
10. Mikroorganisme dalam suatu medium. 

Teknik aseptik dapat dilakukan di dalam Laminar air flow (LAF) atau di meja lab yang bersih. Jika pekerjaan dilakukan di dalam LAF, bunsen tidak boleh menyala pada saat turbin angin aktif. Langkah-langkah melakukan teknik aseptik:

1. Cuci tangan dan keringkan. Lalu gunakan sarung tangan dan semprot dengan semprotan alkohol 70%. 
2. Semprot alkohol 70% pada meja kerja dan bersihkan dengan tisu. Bersihkan semua area tempat kamu akan mengerjakan inokulasi. 
3. Nyalakan bunsen. Buka plastic wrap yang membungkus Petri dish medium kosong dan mikroorganisme, panaskan setiap pinggir Petri dish. Ini akan membunuh mikroorganisme kontaminan yang menempel di pinggir-pinggir medium. 
4. Panaskan loop hingga membara. Biarkan sebentar agar dingin lalu ambil satu koloni dari Petri dish yang ditumbuhi mikroorganisme. Jika loop yang digunakan terlalu panas, medium akan meleleh dan mikroorganisme akan mati. Tutup Petri dish yang digunakan. 
5. Buat beberapa garis (saling menyatu) di permukaan medium. Pada saat melakukan ini, jangan terlalu menekan loop agar medium tidak terobek. 
6. Tutup Petri dish, panaskan pinggirannya dengan bunsen, segel dengan plastic wrap, dan beri label. Lakukan hal yang sama dengan Petri dish lainnya. 
7. Panaskan loop hingga membara. Matikan bunsen. Semprot area yang digunakan dengan alkohol 70%. Semprot juga sarung tangan. 
8. Buang sarung tangan dan cuci tangan. 
9. Inkubasi Petri dish pada suhu optimal mikroorganisme yang diinokulasi. 

Loop atau Needle?

Alat untuk meinokulasi mikroorganisme ada yang berbentuk bulat (loop) dan jarum (needle). Loop digunakan untuk inokulasi ke medium cair dan medium plate (Petri dish). Needle digunakan untuk membiakkan mikroorganisme dengan cara menusuk seperti pada inokulasi ke medium semi-solid atau medium agar tegak. 

sumber: www.sigmaaldrich.com

Loop dan needle ada yang berbahan plastik (sekali pakai) dan krome (bisa dipakai berkali-kali). Untuk kultur cair, ukuran diameter loop juga menentukan volume mikroorganisme yang dimasukkan.  

Metode Penggoresan 
Streaking method - Metode Gores
Fungsinya untuk mendapatkan koloni yang murni dari koloni-koloni lain.

sumber: www.medlabmaven.com

Prinsipnya, inokulum digoreskan pada permukaan agar menggunakan loop. Sel-sel mikroorganisme menempel di sepanjang garis yang dibuat. Secara detail langkahnya adalah (T-streak):

1. Panaskan loop, diamkan sebentar (5 detik). Ambil satu loop dari kultur dan lakukan goresan pada setengah medium. Panaskan loop dan diamkan sebentar lagi. 
2. Loop yang sama digoreskan pada area I ke area II sebanyak tiga goresan. Loop dipanaskan dan dibiarkan sebentar. 
3. Loop yang sama digoreskan dari area II ke area III, hanya satu goresan. Loop dipanaskan. Panaskan pinggir petri dan segel dengan plastic wrap. 

Selain T-streak ada juga quadran streak (4 area), yang berbeda hanya jumlah area streak. Cara-cara ini dilakukan untuk memisahkan mikroorganisme sejenis menjadi hanya beberapa koloni (ditemukan terutama pada area terakhir yang di streak). Koloni yang terbentuk akan berupa titik-titik.

Berikut jenis-jenis streak yang bisa kamu coba selain T-Streak:

a. Quadrant Streak (Metode A)

1. Panaskan loop. Ambil satu loop dari kultur dan gores-goreskan pada area I yang dekat dengan ujung petri. 
2. Panaskan loop dan diamkan sebentar. Lakukan 5-6 goresan dari area I ke area II (masih dekat dengan ujun petri.
3. Panaskan loop, diamkan sebentar. Lakukan 6-7 goresan dari area II ke area III (masih dekat ujung petri. 
4. Panaskan loop, diamkan sebentar. Lakukan goresan sebanyaknya ke tengah medium dari area III ke ara IV (area tersisa di medium). 
5. Panaskan loop dan sisi petri. Segel petri dengan plastic wrap. 

b. Quadrant Streak (Metode B)

1. Panaskan loop diamkan sebentar. Ambil satu loop dari kultur dan gores tanpa terputus (goresan S)  pada area I. I
2. Panaskan loop diamkan sebentar. Putar petri 90 derajat untuk memudahkan penggoresan pada area lain. Buat goresan tanpa terputus dari area I ke area II. Titik gores dimulai dari bagian medium yang steril untuk memastikan loop dingin. Saat membuat goresan, sentuh beberapa kali area I. 
3. Lakukan hal yang sama untuk area III dan area IV. Untuk area IV, sisa goresan dilanjutkan ke tengah medium. 

c. Radiant Streak 

1. Panaskan loop diamkan sebentar. Goreskan satu loop pada area I (dekat pinggir petri. 
2. Panaskan loop diamkan sebentar. Buat 7 - 9 goresan dari area I ke tengah medium. 
3. Panaskan loop diamkan sebentar. Buat 5 goresan tegak lurus dari goresan-goresan sebelumnya.  

d. Continuous Streak 

1. Panaskan loop, ambil satu loop dari kultur dan lakukan satu goresan tak terputus dari ujung ke ujung petri. Panaskan loop dan ujung petri. Segel petri. 
2. Cara lain: penggoresan tak terputus dilakukan hanya di setengah bagian petri. Petri kemudian diputar 180 derajat dan penggoresan tak terputus dilakukan kembali pada bagian yang lain, tanpa loop dipanaskan terlebih dahulu. Panaskan loop dan ujung petri. Segel petri. 

Spreading method - Metode Sebar
Fungi untuk menginokulasi penyebaran mikroba dan juga penghitungan jumlah koloni.

Prinsipnya setetes inokulum dari kultur cair pada permukaan agar akan disebar dengan batang kaca yang bengkok (batang kaca ini disterilkan dulu dengan mencelupkannya di etanol dan dipanaskan dengan bunsen). Koloni yang terbentuk adalah titik-titik kecil yang menyebar dan saling terpisah.

Pouring method - Metode Tuang 

Cara lain plating untuk menghitung jumlah koloni, terutama untuk mikroorganisme mikroaerofilik. Koloni yang tumbuh berada di permukaan atau di dalam agar.

sumber: microbenotes.com

Prinsipnya adalah menuangkan medium agar pada Petri dish yang sudah ditetesi inokulum kultur cair. Medium yang dituang tidak boleh terlalu panas (permukaan dalam tangan tidak terasa sakit). Pengadukan dengan arah 8 dilakukan agar koloni tersebar merata.

Semoga artikel ini membantumu :)
Lihat lagi artikel mengenai bioteknologi (klik judul)

Referensi:

Aryal, S. 2020. Pour Plate Technique - Procedure, Significance, Advantages, Limitations. Retrieved from Online Microbiology Notes: https://microbenotes.com/pour-plate-technique-procedure-significance-advantages-limitations (5 Februari 2020). 

K. 2012. How to Achieve Isolated Colonies. Retrieved from MedLabMaven: http://www.medlabmaven.com/2012/08/how-to-achieve-isolated-colonies.html (5 Februari 2020).

The LibreTexts. 2019.  Aseptic Technique, Dilution, Streaking, and Spread Plates. Retrieved from Biology LibreTexts: https://bio.libretexts.org/Bookshelves/Microbiology/Book%3A_Microbiology_(Boundless)/6%3A_Culturing_Microorganisms/6.3%3A_Culturing_Bacteria/6.3D%3A_Aseptic_Technique%2C_Dilution%2C_Streaking%2C_and_Spread_Plates (5 Februari 2020).