Herbal Story #3: Screening Fitokimia

Banyaknya jenis natural product memberikan peluang manfaat kesehatan yang bervariasi. Jenis senyawa bioaktif yang berbeda pada satu tanaman dapat terekstraksi menggunakan pelarut yang berbeda. Oleh karena itu, kita tidak dapat langsung mengira hasil ekstraksi yang diperoleh mengandung senyawa bioaktif yang sesuai dengan yang dikira Lalu apa yang harus dilakukan?

Phytochemistry screening adalah metode yang dilakukan untuk mengidentifikasi jenis senyawa bioaktif seperti alkaloid, terpenes, tanin, dan flavonoids. Uji yang dilakukan akan berbeda tergantung jenis senyawa bioaktif yang akan diuji. Uji ini dilakukan setelah ekstraksi dan merupakan uji kualitatif, sehingga hasil yang didapat bukan dalam angka (uji kuantitatif) melainkan sesuatu yang dapat dinilai oleh indera.

A. Alkaloids (4 jenis pengujian)

1. Mayer Reagent 
Reagen yang digunakan ketika berinteraksi dengan senyawa alkaloid akan menghasilkan presipitat (endapan) berwarna putih kekuningan/krim.

Uji positif dapat dilihat pada tabung reaksi kanan.
Sumber: Ravi, 2016 

Cara membuat Mayer Reagent cukup dengan melarutkan 1,36 gram merkuri klorida dan 5 gram potassium iodida dalam air 100 ml. Alkaloid memiliki atom nitrogen yang memiliki pasangan elektron bebas. Pasangan elektron ini akan berikatan secara kovalen dengan ion potassium/kalium dari potassium iodida, membentuk kompleks potassium-alkaloid yang terlihat sebagai presipitat putih.  

2. Dragendorff Reagent 

Reagen yang digunakan akan membentuk presipitat jingga kecoklatan.

Presipitat berwarna coklat dapat dilihat pada tabun reaksi paling kanan.
Sumber: youtube.com

Cara membuat:

• Buatlah campuran yang terdiri dari 17 gram bismuth sub-nitrate, 20 ml asam asetat glasial, 80 ml air, dan 100 ml larutan potassium iodida 50% dalam air. 
• Campuran diaduk dan disimpan sebagai larutan stock
• Untuk menggunakan larutan (membuat larutan kerja), larutan stock sebanyak 10 ml dicampur dengan 20 ml asam asetat glasial. Campuran ditambah dengan air hingga mencapai volume 100 ml. 

Reagen Dragendorff mengandung atom logam berat (BiI4) yang bereaksi dengan nitrogen pada alkaloid membentuk pasangan ion. Reaksi inilah yang kana membentuk kompleks jingga kecoklatan. Kualitas warna bisa bervariasi tergantung posisi amine.

Reagen ini dapat menghasilkan uji false-positive (hasil positif, tapi sebenarnya tidak) dimana reagen bereaksi dengan nitrogen pada ikatan peptida protein. Untuk menghindari hal ini dapat dilakukan penambahan ammonia pada ekstrak, dilanjutkan dengan pembilasan klorofom, sehingga alkaloid terpisah dari ekstrak dan pengujian hanya mendeteksi nitrogen dari alkaloid saja (Okhundedaev, 2018 - researchgate.net).

3. Wagner Reagent 

Reagen yang digunakan akan membentuk presipitat berwarna coklat. Cara membuat Wagner Reagen cukup dengan melarutkan 2 gram iodin dan 6 gram potassium iodida dalam 100 ml air.

Presipitat berwarna coklat pada tabung reaksi sebelah kanan.
Sumber: Ravi, 2016

4. Hager's Reagent 
Uji dilakukan dengan menambahkan 3 ml reagen Hager (1 gram picric acid dalam 100 ml air). Hasil positif adalah presipitat kuning. 

B. Saponins (4 jenis pengujian)

1. Uji Froth 

Merupakan uji yang dilakukan dengan mengocok larutan aqueous sampel. Larutan yang mengandung saponin akan membentuk busa yang tidak akan hilang lebih dari 15 menit. 

Saponin memiliki struktur yang terbagi sebagai aglikon (non-gula) dan glykon (gula). Aglikon/sapogenin ada yang bersifat netral dan asam. Saponin netral memiliki aglikon steroid sementara saponin asam memiliki aglikon triterpenoid sehingga hasil uji akan berbeda berdasarkan keberadaan aglikon. 

2. Uji Salkowski 

Uji Salkowski dilakukan untuk menguji steroid atau saponin netral. Uji dilakukan dengan mereaksikan sampel dengan 3 ml kloroform anhidrat dan 3 ml asam sulfat terkonsentrasi. Campuran yang telah diaduk akan menghasilkan warna merah kebiruan hingga merah-violet. 

3. Uji Lieberman-Bourchard 

Reagen Lieberman-Bourchard yang bereaksi dengan senyawa yang mengandung saponin akan menghasilkan warna. 

Jika steroid/ saponin netral, dihasilkan cincin biru kehijauan.

Jika saponin asam,  dihasilkan cincin berwarna ungu. 

Bagaimana melakukan uji ini?

Asetat anhydrida sebanyak 2 ml dan beberapa tetes asam sulfat terkonsentrasi dimasukan ke dalam tabung reaksi yang telah mengandung 2 ml hasil ekstrak.

4. Uji hemolisis
Tambahkan 0,2 ml larutan saponin (dalam 1% normal saline) ke 0,2 ml darah dalam normal saline. Campur dan sentrifugasi. Buat kontrol dengan mencampur 0,2 ml darah 10% dalam normal saline dengan 0,2 ml normal salin. Bandingkan warna merah keduanya. 

C. Triterpenoids (1 jenis pengujian)

1. Uji dapat juga dilakukan dengan Lieberman-Bourchard. Ekstrak 2 mg dilarutkan dalam acetic anhydride, dipanaskan hingga mendidih, dan didinginkan. Sampel kemudian diteteskan dengan 1 ml asam sulfat terkonsentrasi pada dinding tabung. Reaksi positif akan menghasilkan cincin pink-ungu. 

E. Phenol dan Flavanoids  (5 jenis pengujian)

1. Uji dengan Asam Sulfat 

Untuk uji flavone dan flavonol dimana reaksi akan menghasilkan larutan berwarna kuning tua. 

Untuk uji chalcone dan aurones dimana reaksi akan menghasilkan larutan berwarna merah atau merah kebiruan. 

Untuk uji flavanones dimana reaksi akan menghasilkan larutan berwarna jingga hingga merah. 

2. Uji Shinoda 

Uji Shinoda dilakukan dengan mencampur sampel dalam larutan 5 ml alkohol 95 % dengan 0,5 gram magnesium, t-butil alkohol dan beberapa tetes asam klorida pekat. Reaksi dengan flavone atau flavonol akan menghasilkan lapisan pink di atas larutan. 

3. Uji Besi (III) klorida 

Senyawa fenolik yang direaksi dengan Besi (III) klorida 5% akan menghasilkan senyawa berwarna hijau tua/ coklat tua. Senyawa polifenolik, senyawa yang dideteksi oleh metode ini, memiliki gugus OH yang akan bereaksi dengan besi (III) klorida membentuk kompleks berwarna coklat tua atau hijau tua.   

4. Uji Lead acetate 
Ekstrak ditambah dengan larutan lead asetat akan membentuk presipitat kuning.

5. Uji Sodium hidroksida 
Ekstrak ditambah dengan sodium hidroksida akan membentuk warna kuning yang akan hilang jika ditambah asam asetat glasial.

F. Tannins (1 jenis pengujian)
1. Uji FeCl3 
1-2 ml ekstrak etanol ditambahkan dengan beberapa tetes larutan FeCl3 5 %. Warha hijau menunjukkan gallotannis, warna coklat menunjukan pseudotannins. 

Apakah semua pengujian ini dilakukan? Tergantung keperluan kamu. Dalam pengujian untuk satu jenis fitokimia, tidak perlu semua pengujian ini dilakukan. Semuanya kembali lagi pada ketersediaan bahan dan fasilitas lab tempat kamu melakukan pengujian.

Informasi pengujian kualitatif ini dapat digunakan untuk data preliminari atau data yang nantinya dimasukkan dalam paper ilmiah. Tambahan, untuk tujuan paper ilmiah, lebih baik data berasal dari uji kualitatif dengan menggunakan TLC (thin layer chromatography).

Semakin berkembangnya teknologi, semakin banyak modifikasi metode phytochemistry screening. Jadi metode yang dijelaskan dalam artikel ini, belum mencakup semua metode yang ada. Namun demikian, metode-metode ini adalah metode yang banyak digunakan dan dikenalkan dalam kuliah. Metode-metode lainnya dapat kamu baca pada referensi yang saya sematkan dibawah. 

Semoga artikel ini membantumu :) - jika ada waktu, artikel ini akan saya update kembali.

Referensi: 
DiVerdi, J. A. 2011. CRC Reference Data. Retrieved from Department of Chemistry Colorado State University: https://sites.chem.colostate.edu/diverdi/all_courses/CRC%20reference%20data/special%20analytical%20reagents.pdf (28 April 2020).

Ravi, R. 2006. Phytochemical Analysis of Ruta Graveolens. Retrieved from Maharaja College: https://www.slideshare.net/rukkurugma/phytochemical-analysis-of-ruta-graveolens (7 Mei 2017).

Researchgate.net. 2014. How Does The Dragendorff Reagent Work for Detecting Alkaloids. Retrieved from Researchgate.net: https://www.researchgate.net/post/How_does_the_Dragendorff_reagent_work_for_detecting_Alkaloids (27 April 2020).

Sabry, M. 2015. Diploma of Quality Control of Natural Products (1213) Lecture 4. Retrieved from SlideShare: https://www.slideshare.net/drmanalsabry/lecture-4-55114198 (28 April 2020).

Warsi & Sholichah, A. R. 2017. Phytochemical screening and antioxidant activity of ethanolic extract and ethyl acetate fraction from basil leaf (Ocimum basilicum L.) by DPPH radical scavening method, International Proceeding. IPCUAD2017, IOP Publishing, IOP Conference Series: Materials Science and Engineering, 259 : 012008.

Catatan kuliah pribadi