Instrument #2: Elektroforesis

Elektroforesis adalah alat yang digunakan dalam analisis DNA. Ketika kita telah mendapatkan DNA dari tahap ekstraksi, selanjutnya kita harus menguraikan DNA tersebut menjadi beberapa band. Lalu bagaiman menggunakan elektroforesis ini?

Ekstraksi DNA memungkinkan kita memperoleh DNA dalam bentuk genom. Genom bisa dikatakan sebagai semua DNA/ informasi biologis yang dimiliki suatu makhluk hidup untuk menunjang kehidupannya. Panjang genom setiap makhluk hidup berbeda-beda, semakin kompleks suatu organisme, semakin panjang genomnya. Contoh Escherichia coli memiliki 4,6 juta base pair atau 4,6 Mb (Mega-basepairs) sementara manusia memiliki sekitar 3.200 Mb.

Untuk menentukan ukuran genom ini, kita harus menggunakan elektroforesis. Elektroforesis adalah alat yang memisahkan molekul/komponen berdasarkan perbedaan migrasi dalam suatu medan listrik. Ilustrasi gambarnya dapat dilihat seperti berikut:

Keseluruhan proses elektroforesis gel
sumber: San Dieogo Mesa College, 2011

Ini contoh elektroforesis gel, yang akan kita bahas
Pada elektroforesis gel, fase diam/ medium adalah gel dari agarosa atau poliakrilamida.

DNA memiliki muatan negatif dari gugus fosfat. Elektroforesis menggunakan aliran listrik dari satu kutub ke kutub lainnya. Karena DNA bermuatan negatif, DNA akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif. Pada migrasi inilah, DNA akan melewati medium berpori dan terpisah berdasarkan muatan, massa, dan bentuk molekulnya.

DNA yang berukuran lebih besar akan bergerak lebih lambat dan berada di urutan teratas agar sementara DNA yang lebih kecil, karena bergerak lebih cepat, akan berada di bagian bawah agar. Untaian DNA yang memiliki ukuran yang sama akan berkumpul pada suatu urutan, membentuk band. 

1. Bagaimana cara menggunakan elektroforesis?
A. Persiapan dan Perakitan 
Rambut harus diikat, gunakan jas lab (lengan panjang). Siapkan ethanol 96% dalam botol semprot. Cuci tangan, gunakan sarung tangan (tidak bertepung), kaca mata pelindung, masker, dan semprotkan ethanol untuk sterilisasi tangan. Bersihkan area kerja menggunakan etanol 96% dan tissue. 

Beberapa alat perlu diautoklaf. Jika terjadi kontaminasi mikroba atau debu, visualisasi gel akan menghasilkan bintik-bintik yang mengganggu pengambilan gambar. Autoklaf juga mencegah kerja enzim nuklease.

Perakitan instrumen gel elektroforesis tergantung dari merek yang dibeli. Untuk contoh perakitkannya saya sertakan video berikut:   

B. Gel agarosa dibuat 1% menggunakan TAE. 
Selain TAE, buffer TBE juga bisa digunakan (lihat poin ke 4 untuk mengetahui perbedaannya). Jika sudah menggunakan TAE, untuk running buffer sebaiknya menggunakan jenis buffer yang sama.

Air tidak dapat digunakan sebagai substitusi kedua buffer. Jika kamu menggunakan air sebagai buffer, DNA tidak akan bermigrasi karena air tidak mengandung ion untuk konduksi elektrik. Selain itu, gel akan meleleh.

Setelah agarosa dilarutkan dalam 1x TAE/TBE, panaskan dalam microwave selama 1-3 menit atau hingga agarosa benar-benar larut (ditandai dengan warna bening). Usahakan jangan terlalu mendidih supaya buffer tidak menguap dan memengaruhi konsentrasi gel. Keluarkan gel agarosa dengan sarung tangan pelindung panas. Diamkan sebentar (sekitar 5 menit hingga suhu sekitar 60ºC).

Tips #1: 
Untuk menghindari perubahan konsentrasi karenta penguapan. Kamu bisa menimbang berat Erlenmeyer dan larutan gel. Setelah dipanasankan  dan penguapan larutan berhenti,l timbang berat akhir. Tambahkan ddH2O hingga berat awal. (Ingat bukan buffer-nya ya).

Pastikan posisi elektroforesis rata menggunakan water pass. Letakan comb (cetakan well) dan tuang gel agarosa perlahan-lahan untuk menghindari terbentuknya gelembung. Tunggu hingga gel mengeras (biasanya sekitar 30 menit, 1 jam lebih baik).

Mengapa gel agarosa yang dibuat harus 1%? - Konsentrasi gel akan memengaruhi migrasi DNA. Semakin tinggi konsentrasi gel, semakin lambat pergerakan DNA. Semakin rendah konsentrasi gel, DNA akan bergerak lebih cepat. Itu konsepnya. Namun, karena konsentrasi gel juga menentukan besar pori-pori gel yang terbentuk, maka bisa saja penggunaan konsentrasi gel tidak ketat 1%. Konsentrasi 1% ini hanya standarnya.

Konsentrasi gel yang lebih dari 1% (2 %) digunakan untuk memisahkan DNA berukuran kecil (0,2 - 1 kb).  Konsentrasi gel yang tinggi dapat menyebabkan kelarutan agarosa tidak rata sehingga mudah rapuh  Konsentrasi gel yang lebih rendah 1% (0,8 %), digunakan untuk memisahkan DNA berukuran besar (5 - 10 kb), Konsentrasi gel sekitar (0,1 - 0,2 %) yang rendah juga menghasilkan gel yang rapuh dan sulit digunakan untuk proses elektroforesis.

Setelah gel agarosa mengeras, cabut comb. Tuang buffer (jenis dan konsentrasi buffer harus sama dengan yang digunakan untuk gel) hingga gel tenggelam sekitar 2 - 5 mm. Terlalu banyak buffer yang dimasukkan, migrasi DNA akan melambat, terjadi lpeningkatkand DNA, dan panas.

B. Sampel dicampur dengan loading dye di atas kertas parafil
Sampel yang akan dicampur adalah fragmen DNA yang diperoleh dari polymerase chain reaction (PCR). Bisa juga langsung menggunakan DNA yang baru kita ekstraksi dari bab sebelumnya (genom). Namun guna PCR adalah mengamplifikasi (memperbanyak) fragmen DNA yang dituju, sehingga kita memiliki sampel DNA yang sedang kita pelajari dalam jumlah banyak, yang akan meningkatkan resolusi band di gel.

Sampel genom atau PCR, hasil gel elektroforesisnya adalah satu band. Kecuali dalam satu sampel ada lebih dari satu panjang fragmen.

Photo by me.me

Loading dye (atau tracking dye) adalah pewarna yang dicampurkan ke dalam sampel untuk mempermudah visualisasi proses elektroforesis. Loading dye diperlukan agar kita mengetahui apakah sampel bergerak di dalam gel dan apakah proses elektroforesis sudah selesai. Loading dye juga berperan sebagai 'pemberat' sehingga semua DNA dapat tenggelam masuk ke dalam well.


Loading dye umumnya dibuat dari bromophenol blue, Ficoll 400, dan air. Bromophenol blue ini yang memberikan warna biru pada proses elektroforesis. Ficoll 400 atau glycerol pada loading dye yang memberatkan DNA.  

Loading dye bisa saja dicampur dengan buffer (Tris-HCl) dan EDTA (campuran disebut loading buffer). Cek apakah garam buffer dapat digunakan untuk gel. Jika terlalu tinggi, loading buffer dapat diencerkan sebelum pencampuran.

Perlu diingat: loading dye bromophenol blue menjadi band pada 200 - 400 bp DNA. Jika ada fragmen DNA yang memiliki ukuran sekitar 200 - 400 bp, lebih baik mengganti bromophenol blue dengan yang lain. *baca link di referensi untuk mengenal loading dye yang lain.

Sumber: https://geneticeducation.co.in/dna-gel-loading-dye/

Pencampuran sampel dan loading dye di atas kertas parafil adalah teknik yang diajarkan saat saya mahasiswa. Entah apakah ada teknik lain selain itu. Penggunaan kertas parafil memudahkan kita melihat apakah sampel benar-benar tercampur dengan loading dye dan semua campuran tersebut terambil dengan mikropipet. Pencampuran dalam mikrotube mungkin bisa dilakukan. Namun, untuk mahasiswa sering kali beberapa mikroliter sampel tertinggal karena menempel dengan dinding microtube. Sayang banget, DNA susah didapatkan!

C. Campuran dimasukkan ke dalam well. 
Tahap ini yang biasanya menarik untuk anak SMA dan mahasiswa bioteknologi awal. Mikrotips yang digunakan adalah mikrotips putih dengan skala volume 1-10 mikroliter, sangat kecil. Perlu ketenangan dan jam terbang untuk dapat memasukan sampel DNA ke dalam well. Pastikan dulu di mana wellnya baru kamu masukan sampel DNA tersebut. Tetap tenang supaya tangan tidak bergetar.

Jangan sampai well robek atau hasil band akan smeared.

Sumber: https://geneticeducation.co.in/dna-gel-loading-dye/

Gunakan tips yang sama untuk pencampuran sampel-loading dye dan pemasukan ke dalam well. Saat akan mengambil sampel baru, ganti tips. Umumnya tips yang telah dipakai langsung dibuang.

Pada tahap ini, sebaiknya tidak menggunakan well di ujung gel agarosa. Well awal dan terakhir memiliki peluang pemisahan fragmen yang menyimpang. Selain sampel ada juga ladder. Minimal satu ladder dimasukan ke dalam well. Lebih bagus dua, untuk urutan pertama dan urutan terakhir.

Berapa banyak DNA yang dimasukan ke dalam well? Tergantung volume well. Usahakan lebih dari 30% kapasitas maksimum well contoh 6 mikroliter untuk well dengan volume 10 mikroliter, tetapi tidak lebih dari 100%. Supaya DNA terlihat jelas di gel, diperlukan minimal 20 ng DNA.

Terlalu banyak DNA membuat band bergerak sangat cepat dan mungkin akan mengganggu medan elektrik untuk band lain, sehingga band-band muncul pada ukuran basepair yang salah. Jika DNA terlalu sedikit,  band tidak akan terlihat jelas.

Namun demikian, lebih baik memulai dengan volume dan jumlah DNA yang sedikit untuk meningkatkan ketajaman bands. Jika hasil tidak memuaskan, volume DNA dapat ditingkatkan.

D. Buat ladder dari Marker, ddH2O, dan loading dye
Ladder ini seperti kontrol, mengandung band DNA dengan berbagai panjang base pair. Ladder berperan sebagai kontrol untuk membantu memperkirakan berapa panjang base pair sampel DNA kita.

Untuk menentukan marker yang digunakan, biasanya disesuaikan dengan perkiraan ukuran basepair DNA yang kita incar. Marker yang dipilih pastinya memiliki rentang basepair yang dicari. Marker seperti sampel DNA kita, maka ia perlu dicampur dengan loading dye. Air yang digunakan harus air distilasi untuk menghindari ion logam yang dapat mengganggu proses elektroforesis.

Beberapa contoh ladder: lambda Hindlll, lambda Pstl, PhiX174 Haell. Sebelum membeli, baca keterangan produk untuk rentang basepair-nya.

E. Jalankan elektroforesis pada tegangan 5V/cm selama 30 - 45 menit
Tutup gel elektroforesis dan nyalakan elektroforesis pada tegangan 5 V/cm. Jika jarak kutub yang kamu punya 20 cm, maka tegangannya adalah 100 V. Boleh lebih rendah dari 100 V tetapi jangan lebih dari 100 V. Lebih baik lama, setidaknya masih menghasilkan resolusi yang baik daripada meningkatkan voltase untuk  mempercepat proses tetapi gel beresiko panas dan meleleh.

Selain itu, voltase yang terlalu tinggi (di atas 5 atau 8 V/cm) akan mendenaturasi DNA di dalam gel dan menurunkan resolusi band (smear band). Untuk menghindari gel menjadi panas, gunakan kipas angin selama proses elektroforesis.

Tips #2: Beberapa orang juga memilih menggunakan tegangan yang rendah dulu untuk 10 menit pertama, kemudian meningkatkan tegangan menjadi 5 V/cm untuk sisa waktunya.

Tips #3: Kemaleman nih gw mau pulang? Gimana dong? Gunakan tegangan yang lebih rendah 0,25 - 0,5 V/cm kemudian tinggalkan semalaman. Cara ini boleh kok, asal kamu gak rebutan alat dengan yang lain aja. Walaupun voltase dapat dibuat sangat rendah, voltase yang terlalu rendah menyebabkan migrasi DNA yang lambat dan menyebabkan difusi fragmen berukuran kecil sehingga resolusi menjadi rendah.

Nilai voltase ini juga dipengaruhi lagi oleh ukuran fragmen DNA dan jenis buffer yang digunakan. Untuk memastikan nilai voltase yang dianjurkan, sebaiknya melihat ladder yang digunakan.

Untuk mengecek apakah elektroforesis berjalan, lihat elektroda. Jika bergelembung, maka proses elektroforesis sudah berjalan. Jika tidak, cek apakah kabel sudah tersambung.

Elektroforesis sudah bisa dihentikan pada saat loading dye mencapai 3/4 gel. Jadi jika gel memiliki panjang 20 cm, saat loading dye berjarak 5 cm dari ujung  gel, hentikan proses. Cabut kabel, angkat gel.

F. Setelah proses elektroforesis, rendam gel dalam larutan etidium bromida selama 15 menit
Ethidium bromida adalah pewarna fluorescence yang digunakan dalam visualisasi DNA dan RNA dalam gel. Jadi pewarna akhir itu bukan loading dye ya. Ethidium bromida akan berikatan dengan pasangan basa DNA dan berpendar ketika diberi sinar UV (sinar UV 300 - 360 nm).

*Ethidium bromida juga bisa ditambahkan pada gel setelah gel mendingin dari microwave. Ethidium bromida (EtBr) adalah pewarna dengan sensitivitas tinggi (mendeteksi 1ng untai ganda DNA setiap band).

G. Visualisasikan DNA di sinar UV
Dilakukan menggunakan meja yang dilengkapi sinar UV (baik sumber lampu di atas/ epi-illumination atau di bawah/ transillumination). Sebaiknya dilakukan pada ruangan gelap sehingga tidak ada sinar lain yang mengganggu visualisasi. Pada alas meja, lapisi dengan plastic wrap untuk menghindari kontaminasi ethidium bromida, larutan ini bersifat karsinogenik. Potret hasil elekroforesis sampel dan ladder, pastikan semuanya ada dalam satu pengambilan gambar.

Untuk penulisan laporan, ladder pada gambar harus diberikan keterangan ukuran basepair. Misalkan (ini contoh hasil laporan saat saya mahasiswa, maaf jika hasilnya tidak jelas):

Well nomer 1 dan 8 adalah ladder. Terlihat banyak band  yang tidak jelas dan smear. 
Sumber: dokumen pribadi

Sumber: dokumen pribadi

Jadi apa tujuan elektroforesis? 
Utamanya adalah mengetahui ukuran molekul DNA (dalam basepair). Elektroforesis juga digunakan untuk analisis hasil PCR kamu berhasil atau tidak. 

Err... ya.. gak selalu berhasil. Hampir GAK PERNAH berhasil *nangis di kolong meja
Photo by me.me

2. Beberapa Troubleshoot 

3. Konsentrasi dan kemurnian DNA
Berhubung kita membahas elektroforesis, aku mau coba bahas mengenai dua hal ini. Metode ekstraksi DNA yang kita lakukan, walaupun kesannya semua DNA sudah kita peroleh, beberapa molekul lain seperti protein dan fenol. 

Bagaimana menentukan konsentrasi DNA? 
DNA memiliki basa nitrogen yang dapat menyerap sinar UV, maka cara paling sederhana yang dapat kita lakukan adalah mengukur DNA menggunakan spektrofotometer UV. Semakin tinggi nilai absorbansi, semakin banyak sinar UV yang diserap, sehingga kita dapat memperkirakan semakin tinggi konsentrasi DNA pada sampel kita.

Panjang gelombang yang digunakan untuk mengukur absorbansi DNA adalah 260 nm.

Untuk menentukan konsentrasi DNA:

Nilai absorbansi x faktor pengenceran x koefisien A260 

Koefisien A260 = 1.0 setara dengan 50 µg/ml untai ganda DNA murni 

Bagaimana menentukan kemurnian DNA?

Masih menggunakan spektrofotometer, ukur nilai absorbansi sampel pada 280 nm. Ini adalah panjang gelombang yang diserap protein. Kemudian tentukan rasio A260/A280 (rasio absorbansi pada 260 nm dengan absorbansi 280 nm). 

Nilai rasio harus diantara 1,8 - 2,0. 

Jika kurang dari 1,8 = adanya pengotor protein atau fenol 

Jika lebih dari 2,0 = adanya RNA  

4. Running buffer - 1x TAE vs 0.5 - 1x TBE 
Buffer berfungsi menjaga strukutr DNA agar tidak mengalami kerusakan atau perubahan selama proses purifikasi dan mencegah aktivitas enzim pendegradasi. Buffer yang digunakan harus memiliki pH 5 - 12. Buffer yang terlalu asam menyebabkan depurifikasi dan mengakibatkan DNA terdistribusi ke fase fenol sementara pH terlalu basa menyebabkan pemisahan untai ganda DNA.

TBE - Tris Borate EDTA merupakan buffer yang cocok untuk sampel bersifat basa lemah. TBE dipilih untuk prosedur yang menyangkut asam nukleat, mampu memisahkan fragmen DNA berukuran kecil ( DNA < 5 kb; RNA < 1,5 kb), dan memiliki kapasitas buffer yang lebih tinggi sehingga memberikan resolusi yang lebih jelas dibanding TAE.

TAE - Tris Acetate EDTA merupakan buffer yang cocok untuk fragmen DNA yang berukuran besar (DNA > 1 kb; RNA > 1,5 Kb). TAE lebih cocok digunakan untuk menyimpan DNA yang akan digunakan untuk aplikasi enzimatik (restriction digestion, cloning, dan PCR) atau melakukan elektroforesis DNA supercoiled .

Untuk elektroforesis gel, lebih baik menggunakan TBE karena DNA di dalam TBE lebih dapat menjaga strukturnya sehingga tidak mengganggu analisis ukuran molekul DNA. TBE juga lebih baik digunakan untuk elektroforesis > 150 V (atau untuk gel agarosa yang panjang) dan > 2 jam.

5. Penyimpanan gel agarosa

1. Hasil elektroforesis dapat disimpan untuk waktu lama menggunakan 70% etanol. 
2. Hindari pemaparan dengan sinar UV yang memiliki panjang gelombang rendah untuk menghidnari mutasi sekuens DNA. Daripada menggunakan sinar UV pada 254-312 nm, gunakan sunar UV pada panjang gelombang lebih tinggi (360 nm).

Semoga artikel ini membantu :)
Elektroforesis memang instrument yang sulit saya pahami. Jika ada pertanyaan atau koreksi boleh tuliskan dalam kolom komentar (tolong sertakan nama. Jika anonim, mohon maaf tidak akan saya baca).

Referensi: 

Campbell, N. A., Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V. & Jackson, R. B. 2008. Biology 8th edition. San Fransisco: Pearson Benjamin Cummings.

Chauhan, T. 2018. DNA Loading Dye. Retrieved from Genetic Education: https://geneticeducation.co.in/dna-gel-loading-dye/ (29 Februari 2020).

Dube, S. 2010. Troubleshooting DNA Agarose Gel Electrophoresis. Retrieved from Department of Biology Davidson College: https://www.bio.davidson.edu/molecular/tips/trblDNAgel.html (29 Februari 2020).

Dube, S. 2010. Top 10 Fun Facts for DNA Electrophoresis. Retrieved from Department of Biology Davidson College: https://www.bio.davidson.edu/molecular/tips/funDNAgel.html (2 Maret 2020).

Harju, S. Fedosyuk. H & Peterson, K. R. 2004. Rapid isolation of yeast genomic DNA: Bust n' Grab, Bio Med Biotechnology, 4:8.

Lewis, M. 2015. Agarose gel electrophoresis (Basic Methods). Retrieved from Methodbook: http://www.methodbook.net/dna/agarogel.html (29 Februari 2020).

Maftuchah, Winaya A. & Zainudin, A. 2014. Teknik Dasar Analisis Biologi Molekuler. Yogyakarta: Penerbit Deepublish.

Nameghi, S. A. 2007. Genotyping Escherichia coli isolates by Pulsed-Field Gel Electrophoresis. Retrieved from Sodertorn University: http://sh.divaportal.org/smash/get/diva2:15489/FULLTEXT01.pdf (15 September 2015).

San Diego Mesa College. 2011. Gel Electrophoresis. Retrieved from San Diego Mesa College: http://classroom.sdmesa.edu/eschmid/Lab12%20-%20Biol210.htm (5 September 2015).

Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta: Penerbit Kanisius.

Thermo Fisher Scientific. Tanpa Tahun. Nucleic Acid Electrophoresis Troubleshooting Guide. Retrieved from Thermo Fisher Scientific: https://www.thermofisher.com/id/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/na-electrophoresis-education/na-electrophoresis-troubleshooting.html (2 Maret 2020).

Thermo Fisher Scientific. Tanpa Tahun. Nucleic Acid Electrophoresis Workflow- 5 Main Steps. Retrieved from Thermo Fisher Scientific: https://www.thermofisher.com/id/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/na-electrophoresis-education/na-electrophoresis-workflow.html#preparing (2 Maret 2020).

Referensi foto cover:
Me.me. Tanpa Tahun. Gel Electrophoresis Hope Expectation Reality. Retrieved from Me.me: https://me.me/i/gel-electrophoresis-hope-expectation-reality-927ebe9d4281492bb12d9ca7187dfba9 (2 Maret 2020).

Special thanks:
A. Jounathan
M. Suhardi
Y. Laurensia
A. Admadja
D. Rizkinata
V. Ganda

F. M. Eddy

J. Sumitaro

M. Theresia