Instrumen #3: SDS Page (Prosedur dan Mekanisme Kerja)

Setelah mengetahui bagian-bagian dan bahan yang diperlukan dalam SDS PAGE, sekarang kita bahas cara memasang peralatan tersebut. Yes it is complicated.


Pembuatan bahan dimulai dari: 
Larutan A - Larutan Akrilamida/ Bis
Larutan B -  Larutan 1,5 M Tris HCl pH 8,8
Larutan C -  Larutan Tris HCl pH 6,8
Larutan D -  Larutan SDS
Larutan E - 10% Ammonium persulfat
*Untuk mengetahui cara membuat setiap larutan, lihat lagi part I.

1. Bagaimana Meng-adjust pH? 
Adjusting pH diperlukan dalam membuat larutan Tris HCl. Alat yang diperlukan adalah pH meter, beaker, dan labu takar 25 ml (jika volume larutan total yang dibuat adalah 25 ml). Perhatikan langkah berikut:

a. Campuran awal 
Misalkan larutan total adalah 25 ml, jangan langsung menyiapkan 25 ml akuades. Karena kita akan melakukan adjusting, akan terjadi peningkatan volume larutan. Jika akuades yang disiapkan sudah 25 ml, akan terjadi pergesaran konsentrasi karena adanya perubahan volume larutan. Jadi, masukan Tris dengan massa untuk 25 ml tetapi dalam air di bawah 25 ml, misalkan 15 ml. Semua ini disediakan dalam Beaker.

b. Adjust pH dengan pH meter 

Ilustrasi pH meter
Sumber: https://indonesian.alibaba.com/product-detail/digital-benchtop-auto-or-manual-ph-meter-price-711428997.html

Tergantung dari alat pH meter yang digunakan lagi, umumnya pH meter memiliki elektroda pada ujung rodnya. Elektroda ini harus hati-hati, tidak boleh tersentuh jari dan ketika selesai digunakan harus terendam dalam buffer yang ada di dalam tutupnya.

1. Sebelum digunakan, elektroda harus disiram akuades dan dikeringkan dengan tissue dengan cara ditap-tap pada ujung elektrodanya. Klik SC untuk penghitungan optimal agar pH tidak terhitung terus. 
2. Penghitungan pH dilakukan dengan mencelupkan elektroda pada larutan. Jaga elektroda tidak menyentuh dasar gelas, cukup ujung elektrodanya terendam, Tunggu hingga SC tidak berkedip lagi atau ada bunyi. Catat pH awal. 
3. Letakan Beaker larutan pada stirrer, teteskan HCl sedikit dulu. Karena adjusting ini lebih ke perabaan, kita tidak tahu berapa tetes yang digunakan untuk mencapai pH yang diinginkan. 
4. Jalankan stirrer dengan klik start. Tunggu sebentar dan klik lagi untuk menghentikan stirrer. Hitung kembali pH dengan cara yang sama. 
5. Setelah dihitung, bilas rod dengan akuades, tap-tap dengan tissue dan masukkan dalam tutup yang berisi buffer.

Jika berlebihan dan pH harus dinaikan bagaimana? Bisa menggunakan NaOH untuk meningkatkan pH tetapi tris-HCl pada dasarnya tidak memiliki NaOH sedikitpun. Seandainya PH turun melebihi yang diinginkan, tidak bisa dinaikan lagi. Maka, hati-hati.

c. Tuang ke labu takar, dan tambah akuades hingga 25 ml, bolak-balik

2. Persiapkan Buffer 
Buat running buffer (mengandung Tris, glisin, SDS, akuades)
Buat sampel buffer. (mengandung Tris, gliserol, SDS, 2-merkaptoetanol, akuades, bromophenol blue)

3. Perakitan Alat dan Pembuatan Gel 
a. Perakitan gel cassette assembly 
Sebelum memulai gunakan sarung tangan, pastikan penyusunan komponen sesuai, bersih, dan kering. Hati-hati saat menggunakan poliakrilamida karena bersifat berbahaya. Siapkan botol berisi akuades dan tissue. 

Susun gel cassette sandwich pada permukaan yang bersih. Susun gel cassete assembly dengan mendirikan casting frame dan cassete sandwich. Tahan cassette sandwich menggunakan cams pada casting frame. Letakan spacer plate (plat kaca yang tinggi) terlebih dahulu sebelum meletakan short plate. Pastikan kedua plat sejajar.

Letakan gel cassette assembly pada casting stand, dan kencangkan dengan cams pada bagian atas casting stand. Pastikan gasket dan ujung gel cassette sandwich tertahan Untuk mencegah kontaminasi cairan dan menjaga kebocoran lebih oke, alasi gasket dengan aluminium foil terlebih dahulu.

Cek kebocoran dengan memasukkan air pada space diantara plat kaca. Jika yakin tidak akan bocor, serap air menggunakan filter paper. Jangan menggunakan tissue karena memiliki serat-serat yang akan menempel pada space, tentunya akan mengganggu kualitas gel. Filter paper yang digunakan dapat dikeringkan untuk digunakan kembali.

Perhatian: Walaupun pada saat pengecekan kebocoran, permukaan air tidak turun, bisa saja gel tetap bocor. Hal ini dikarenakan air memiliki water retension, walaupun molekul air berukuran lebih kecil.

b. Pembuatan gel
Gel yang dibuat disebut dengan casting gel. Persiapkan dua jenis gel yaitu stacking gel dan separating gel. Gel yang digunakan masing-masing 20 ml:

Stacking gel (6% akrilamida) mengandung akuades, larutan C, larutan D, dan larutan A
Resolving/ separating gel (12%) mengandung akuades, larutan B, larutan D, dan larutan A

Volume masing-masing larutan berbeda tergantung penelitian dan referensi yang digunakan. Konsentrasi poliakrilamida pada setiap gel juga berbeda, umumnya stacking gel adalah 4% sementara resolving gel adalah 8 - 20% tergantung massa molekul protein yang akan diteliti.

Perhatian: Saat memindahkan larutan A dengan mikropipet, jika wadah yang digunakan bukan tabung uji, jangan sampai mengenai dinding wadah. Larutan A sebaiknya dimasukkan terakhir untuk mengurangi peluang mengkontaminasi benda lain. Jika dimasukan pertama kali, dan terjadi kesalahan, bahan yang dibuang jadi lebih banyak. Jika terjadi kontaminasi, siram dengan akuades yang telah disiapkan dalam botol sebelumnya. Lap dengan tisu, dan kumpulkan dalam plastik khusus limbah lab.

Setiap gel yang telah dibuat, di degas untuk mengurangi kandungan oksigen yang dapat memengaruhi kualitas gel.

Cara mempersiapkan stacking gel dan resolving gel secara detail. 
1. Resolving gel 
Dipersiapkan terlebih dulu karena merupakan lapisan gel ke dua dari SDS PAGE. Resolving gel disiapkan dengan mencampurkan semua reagen kecuali ammonium persilfat dan TEMED. Kedua komponen ini baru dimasukkan jika kamu sudah siap menuangkan gel ke dalam gel cassette sandwich. Aduk gel perlahan sebelum menuangkannya ke plat.

Tuang hingga batas 1 cm dari short plate. Jika ada gelembung, tambahkan selapis isopropanol atau air distilasi pada lapisan atas gel. Isopropanol digunakan untuk menghilangkan gelembung dan meratakan permukaan resolving gel. Cairan ini tidak akan bercampur karena pada saat gel mengeras, isopropanol pasti ada di permukaan atas karena perbedaan densitas. Isopropanol juga digunakan untuk mencegah oksigen masuk dan menghambat polimerisasi.

Tunggu gel mengeras selama 20-30 menit. Ketika mengeras, isopropanol atau air dapat diserap dengan kertas filter.

2. Stacking gel 
Persiapkan stacking gel dengan mencampurkan semua reagen kecuali TEMED dan ammonium persulfat. Tambahkan ammonium persulfat dan TEMED sesaat sebelum gel dituang. Aduk perlahan sebelum gel dituang. Tuang gel hingga bagian atas dari short plate. Letakan comb pada stacking gel. Tunggu 10 menit. Memang akan ada gel yang keluar, tetapi jangan langsung dibersihkan. Tunggu hingga mengeras baru dibersihkan.Masukan comb untuk membentuk well. 

Catatan: %T dan %C 
%T  adalah total monomer dalam volume gel kita. Semakin tinggi nilai %T, pori-pori yang dibuat akan semakin kecil. Standarnya %T harus 30%

Rumus: %T = (gram akrilamida + gram bis) / volume total (ml) x 100%

Jika nilai %T terlalu banyak maka comb tidak dapat dilepas dari stacking gel. Jika nilai %T terlalu rendah, maka protein keluar dari gel, sedikit band yang muncul daripada yang diharapkan dan ada sebuah band heavy di depan dye. 

%C adalah perbandingan cross linker (Bis) dengan total monomer. Standarnya adalah 2,67% yang akan memengaruhi polimerisasi gel. Jika terlalu rendah, gel menjadi sangat lunak, tetapi jika terlalu banyak, maka gel akan rapuh atau menjadi putih.

%T dan %C, serta dimensi gel harus ditulis pada bab metode suatu paper ilmiah. 

c. Setelah Gel Jadi 
Ambil gel dari casting frame dan kaitkan pada electrode assembly. Pastikan short plate menghadap ke dalam dan terletak dekat dengan rubber gasket untuk menghindari kebocoran. Short plate harus sejajar dengan notch gasket. Jika hanya satu gel yang digunakan, letakan dummy plate untuk menyeimbangkan.

Masukan electrode assembly ke dalam clamping frame. Perlahan tekan bagian atas electrode assembly saat mengunci clamping frame cams. Masukan pada tank. Isi tank dengan 10 SDS running buffer 8,3 baik di inner chamber (125 ml) dan outer chamber (200 ml). Pengisian chamber juga dapat dimulai dari outer ke inner. 

Jika terjadi kebocoran, buffer pada inner akan menurun pelan-pelan. Setelah itu, comb baru dapat diambil, pelan-pelan.

Ada model lain yang tidak menggunakan clamping frame. Prosedur perakitannya sendiri tidak jauh berbeda.

4. Proses SDS PAGE
Sekarang gel dapat diisi dengan sampel dan sample buffer. Berikut langkah-langkahnya:

1. Membuat working sample terdiri dari 95 mikroliter stok sampel dan 5 mikroliter merkaptoetanol.
2. 10 mikroliter sample buffer dicampur dengan 10 mikroliter working sample 
3. Inkubasi pada 100C selama 5 menit. Pemanasan dilakukan agar protein mengalami denaturasi dan terlapis SDS. 2-merkaptoetanol akan menurunkan ikatan disulfida protein. Semua ini untuk membuat protein menjadi bentuk linear-nya. 
4. Dinginkan di ice box hingga suhu ruang. Sampel dapat dimasukkan ke dalam well. Hati-hati dalam memasukan sampel. Well lebih tidak terlihat dibandingkan elektroforesis yang dibahas sebelumnya. 

Sample buffer mengandung gliserol yang akan memberatkan sampel sehingga sebagian besar sampel masuk ke dalam well. Bromotymol blue menjadi tracking dye yang menunjukkan proses elektroforesis terjadi atau sudah selesai, dan juga penanda apakah sampel bergerak keluar dari gel. 

Nyalakan power supply dengan menutup rakitan dengan lid. Pastikan koneksi tepat (hitam dengan merah, merah dengan hitam). Nyalakan voltage sesuai dengan prosedur yang kamu punya. Perhatikan proses, jangan sampai tracking dye keluar dari gel.

Mekanisme Kerja Pemisahan Protein pada SDS PAGE
fiuh... kompleks nya, sekarang sedikit lebih kompleks.. please bear with me

Mekanisme kerja yang akan saya bahas adalah SDS PAGE - discontinous yang menggunakan dua gel. Tujuan menggunakan dua gel adalah untuk memilik resolusi yang lebih baik dan hasil high-througput (kemungkinan smear lebih kecil)

a. Pertama, protein terdenaturasi dengan dipanaskan bersama SDS. Detergen anionik ini akan berikatan pada rantai polipeptida protein, mengganggu konformasi protein sehingga protein terdenaturasi dan bermuatan negatif.

Gel yang digunakan dibagi menjadi stacking gel (Tris-HCl pH 6,8) dan running gel (Tris-HCl pH 8,8). Pada saat sampel dimasukkan ke well, buffer Tris-Gly pH 8,3 (dari running buffer) dimasukkan ke dalam chamber. Buffer ini mengandung Cl- yang merupakan leading ion dan glisin sebagai trailing ion. 

b. Dengan 50 V selama +/- 1 jam, sampel bergerak dari stacking gel hingga running gel (dari elektroda negatif ke posif). Stacking gel memiliki pori-pori yang besar (4%) dan berfungsi untuk membuat protein memasuki running gel pada waktu yang sama (stacking, seperti stacking books). Pada stacking gel, yang memiliki pH 6,8, glisin dari buffer akan terprotonisasi sehingga bermuatan netral). Hal ini membuat glisin bergerak lambat, di belakang Cl-. Sementara Cl- bergerak paling depan karena memiliki muatan negati yang lebih besar.

Pada saat Cl- turun, terbentuk daerah dengan kondiktivitas rendah dan penurunan voltase diantara Cl- dan glisin. Medan ini menarik glisin sehingga glisin yang awalnya bermuatan netral, menjadi sedikit bermuatan dan ikut bergerak. Daerah yang mengalami perubahan gradian voltase ini akan menyapu protein, membuat protein tertahan di antara glisin dan Cl-. Hal ini membentuk sharper band yang sejajar sampai di ujung awal running gel. Tanpa stacking gel, band yang dihasilkan akan smear karena tidak sejajar.

c. Memasuki running gel, voltage ditingkatkan menjadi 100 V selama 1 jam dan pemisahan pun terjadi. pH yang tinggi meningkatkan ionisasi ion glisilat sehinga ion ini bermuatan negatif dan bergerak lebih cepat daripada protein.

Protein yang berikatan dengan SDS memiliki perbandingan 1 gram protein : 1,4 gram SDS. Jadi satu mol protein memiliki satu muatan negatif. Maka, semakin besar massa molekul protein, muatan negatif protein akan semakin besar. Namun, protein dengan massa molekul yang lebih besar ini tidak bergerak lebih cepat daripada yang kecil karena tertahan oleh pori-pori running gel yang kecil (12%). Protein dengan massa molekul yang lebih berat akan diletakan paling atas, dan sebaliknya. Jadi muatan negatif hanya menggerakan protein menuju elektroda positif, sementara pemisahan hanya berdasarkan massa molekul protein. (Berbeda dengan elektroforesis DNA, DNA bergerak karena muatannya, sementara pada SDS PAGE, protein digerakan)

Selama proses ini, glisin dan Cl- yang turun akan meningkatkan gradient voltase yang akan meningkatkan suhu gel. Suhu gel yang meingkat menyebabkan pH akhir running gel menjadi pH 9,5.

5. Staining Gel 

1. Matikan power supply, dan ambil gel casette sandwich.
2. Keluarkan hanya resolving gel dengan sudip. 
3. Masukan resolving gel ke dalam toples da tuang staining solution. Diamkan 15 menit sambil diputar secara manual 
4. Buang staining dan masukan destain solution. Diamkan selama 30 menit sambil diputar secara manual. 
5. Ganti destaining solution dengan yang baru dan diamkan semalaman. 

6. Pengamatan 
Siapkan talenan atau area datar dan lapisi dengan plastic wrap. Ganti destain solution dengan PBS. Tuang air/ PBS pada plastic wrap dan letakan gel. Beri air/ PBS jika diperlukan. Lakukan pengamatan. Jika pengamatan telah dilakukan, gel dapat dimasukkan lagi ke stoples.

Apa yang diamati? Massa molekul, tetapi tidak bisa sembarangan hanya mencocokan band protein dengan markernya. Harus menggunakan persamaan log berat molekul vs Rf

Rf = perbandingan migrasi protein/ migrasi dye.

Dye ini adalah garis akhir running, garis biru tempat bromotymol blue berada. Ingat, bromotymol blue tidak mengikat protein apa pun.

Log berat molekul marker dijadikan standar untuk menentukan sumbu Y, dengan satuan Dalton (Da) sementara nilai Rf marker menentukan nilai sumbu X. Dari sini akan didapatkan rumus persamaan y = mx + b yang akan digunakan untuk menentukan massa molekul protein sampel kita. 

Contoh: 

Rf band sampel adalah x = 0,5 dan dari persamaan didapatkan y = 4,94. 

Tapi ingat:  y = log (MW)

4,94 = log (MW) 

MW = 10^4,94

MW = 87 kDa 

Cara ini mengubah data kita yang merupakan logaritma menjadi data eksponen. 

PS: mengenai MW (molecular weight). Dalam bahasa Indonesia ada yang menyebutnya dengan berat molekul, ada juga massa molekul. Namun satuan Dalton lebih mengacu pada massa molekul sementara berat molekul dinyatakan dalam g/mol, tetapi penggunaan ini dapat bertukar (nterchangeable). 

7. Apakah SDS PAGE dapat digunakan untuk memisahkan DNA? 
a. Gel yang tidak cocok. 
Poliakrilamida dipilih karena memiliki pori-pori yang lebih kecil daripada gel agarosa. Sifat ini diperlukan untuk memisahkan protein yang memiliki molekul yang lebih kecil daripada asam nukleat. Ini juga menjadi alasan mengapa protein tidak dapat menggunakan gel agarosa.

b. Perbedaan teknik dan keperluan 

1. Asam nukleat mungkin dapat menggunakan poliakrilamida, tetapi harus protein dengan massa molekul 500 KDa dan persel gel poliakrilamida adalah 6-8%. 
2. SDS yang digunakan untuk mendenaturasi dan membuat muatan negatif protein tidak diperlukan oleh DNA/RNA karena DNA sudah bermuatan negatif dari gugus fosfat. 
3. DNA/RNA tidak memerlukan merkaptoetanol untuk memotong ikatan disulfida. DNA/ RNA tidak memiliki ikatan disulfida. 
4. Pewarnaan yang digunakan untuk DNA tetap ethidium bromida, yang berinterkalasi diantara basa kedua untai DNA 
5. Tris HCl pada gel agarosa memberikan pH 8,5 dan memberikan keaddaan penyangga. 

Semoga artikel ini membantumu :)

Referensi 
Catatan Kuliah