Instrumen #3: SDS Page (Jenis, Alat, dan Bahan)

Seperti elektroforesis, SDS Page berperan memisahkan suatu molekul berdasarkan berat molekulnya. Namun molekul yang dipisahkan adalah protein.

A. Apa itu SDS PAGE
SDS PAGE adalah alat yang digunakan untuk memisahkan protein berdasarkan berat molekul dimana protein akan dibuat bermuatan negatif terlebih dahulu oleh SDS, lalu dipisahkan dengan PAGE.

1. SDS
Sodium Dodesil Sulfat (SDS) adalah surfaktan anionik yang memiliki ekor dengan 12 karbon yang menempel dengan gugus sulfat. Ekor karbon bermuatan netral sementara gugus sulfat bermuatan negatif (maka disebut surfaktan anionik).

SDS memiliki dua peran:

1. Memutus ikatan non-kovalen protein, sehingga protein menjadi linear dan kehilangan bentuk asalnya. 
2. SDS membuat protein bermuatan negatif. 

Mengapa semua protein harus dibuat linear dan negatif ?

Agar migrasi yang terjadi selama proses pemisahan protein hanya didasarkan oleh ukuran molekul. Secara natural, protein memiliki muatan yang berbeda satu sama lain. SDS akan membuat semua protein ini, apa pun ukurannya, menjadi memiliki muatan negatif yang sama dan rasio muatan per massa yang sama. Maka, pada saat protein bergerak melewati gel, perbedaan kecepatan migrasi protein hanya berdasarkan ukuran mereka, tanpa pengaruh muatan apa pun.  

Faktor ukuran adalah faktor utama yang memengaruhi migrasi. Pada praktiknya, protein yang berikatan dengan banyak SDS adalah protein hidrofobik. Protein yang mengalami post translational modification mungkin berikatan sedikit SDS. Pengaruh ini baru dipertimbangkan jika terjadi anomali migrasi. 

2. PAGE
PoliAkrilamide Gel Electrophoresis, teknik untuk memisahkan makromolekul berdasarkan pergerakan elektrophoretic-nya. Pergerakan disini berarti fungsi dari panjang, konformasi, dan muatan molekul.

Poliakrilamida digunakan untuk membentuk gel (matriks berpori). Dibuat dengan melarutkan poliakrilamida dalam Tris-HCl buffer. Ditambah ammonium persulfate (APS) dan tetramethylenediamine (TEMED) untuk polimerisasinya.

Poliakrilamida dipilih untuk memisahkan protein karena inert secara kimiawi, bermuatan netral, hidrofilik, dan transparan untuk deteksi visual. Gel ini lebih dipilih daripada menggunakan agarosa karena menghasilkan resolusi yang lebih baik.

B. Jenis SDS PAGE
1D SDS PAGE
Pemisahan protein hanya dari berat molekulnya saja. Dari gel bagian atas ke bawah, protein dipisahkan berdasarkan berat molekul tertinggi ke terendah. Namun pada pemisahan ini, satu band yang terbentuk belum tentu satu protein. Bisa saja protein yang berbeda tetapi memiliki berat molekul yang sama.

2D SDS PAGE
Pemisahan protein berdasrkan nilai isoelektrik (pH saat protein tidak memiliki muatan/ pI) ditandai dengan pH dan berat molekul ditandai dengan muatan. pI sebagai dimensi ke satu sementara berat molekul sebagai dimensi ke dua. Dengan teknik ini, dapat dilakukan analisa dengan Mass Spectrometer (MS).

Gambaran 2D SDS PAGE. Garis horizontal adalah pI (1D) sementara garis vertikal adalah berat molekul (2D)

Pemisahan dilakukan berdasarkan pI terlebih dahulu untuk mengetahui muatan asal protein. Selanjutnya dilakukan pemisahan berdasarkan berat molekul. Jika terbalik, akan mengganggu pemisahan pI.

Berbeda dengan SDS PAGE pada umumnya, deterjen yang digunakan adalah deterjen netral dan gel lebih tipis. Deterjen netral digunakan untuk linearing ikatan lemah protein tanpa mengganggu pergerakan protein berdasarkan pI.

Keuntungan menggunakan SDS: akurat, pemisahan bagus, setiap spot yang dipisahkan dapat diisolasi dan dianalisa. Metode pemisahan protein lainnya adalah Native PAGE dan Zymogram.

C. Bagian-bagian Instrumen SDS PAGE
Alat yang akan dijelaskan pada artikel SDS PAGE ini adalah Mini Protein Tetra Cell, yang dapat digunakan untuk melakukan run pada 4 gel (dimana 1 gel memuat 10 well).

a. Gel Cassette Sandwich 
Gel cassete sandwich adalah bagian yang terdiri dari spacer plate, short plate, dan gel spacer. Ketiga bagian ini berperan dalam polimerisasi gel.

Glass plates adalah plat kaca yang digunakan untuk mencetak gel. Plat dibagi menjadi dua, spacer plates dan short plate. Spacers plates adalah plat kaca yang lebih tinggi daripada gel spacer. Memiliki ketebalan 0,75 mm, 1,0 mm, dan 1,5 mm. Short plate, plat kaca yang lebih pendek yang bergabung dengan spacer plate untuk membentuk gel cassette sandwich. 

Gel spacer menyediakan ruang di tengah spacer plate dan short plate.

b. Gel Cassette Assembly 
Gabungan satu casting frame, spacer plate, dan short plate.

Casting Frame mengunci dan mengamankan spacer plate dan short plate yang telah disatukan untuk membentuk gel casette sandwich saat pembentukan gel.

c. Casting Stand 
Mengamankan gel cassete assembly selama pembentukan gel. Terdapat kenop yang dapat mengunci gel cassette assembly dan casting gasket. 

Ada semacam gabus berwarna abu pada gambar, ini disebut gasket, untuk menjaga agar gel yang dituang tidak bocor. Untuk mencegah kontaminasi cairan dan menjaga kebocoran lebih oke, alasi gasket dengan aluminium foil terlebih dahulu.

d. Buffer Dam/ Plate dummy
Selapis kaca yang digunakan sebagai substitusi saat jumlah gel yang dirunning ganjil (satu atau tiga gel). Bagian ini harus ada agar buffer dalam inner chamber tidak mengalir keluar ke outer chamber.

e. Electrode assembly
Menahan gel sandwich. Di dalamnya terdapat U shaped gasket, anoda plug, katoda plug. Anoda ditandai dengan warna merah, sementara katoda ditandai dengan warna hitam. Pada bagian ini juga terdapat notch on U shaped gasket, bagian untuk meletakan gel cassette sandwich.

Electrode assembly. Lihat plat kaca pada gambar? Itu adalah plate dummy

f. Companion Assembly 
Memungkinkan running gel ke tiga dan ke empat. Menahan gel sandwich dan memiliki sealing gasket.

g. Mini Tank dan Lid
Merupakan tangki dan penutup yang digabungkan untuk menutup ruangan dalam sepenuhnya selama proses elektroforesis berlangsung. Mengikuti gambar dibawah, kabel merah dari penutup disambungkan dengan katoda plug (hitam), dan sebaliknya. Tutup tidak dapat dilepas tanpa mengganggu sirkuit listrik, sehingga aliran listrik harus dipastikan sudah mati sebelum membuka tutup tangki.

h. Clamping Frame 
Tempat meletakan elektroda assembly, dan bersama-sama dengan elektroda assembly disebut sebagai inner chamber assembly. Clamping frame menjadi wadah untuk menampung buffer pada inner chamber. Cams pada clamping frame berperan untuk mengkait elektroda assembly. Bagian ini juga merupakan tempat plat dummy diletakan.

i. Comb 
Untuk membentuk well, seperti comb pada elektroforesis.

D. Larutan-larutan yang Digunakan dalam SDS PAGE
Dalam membuat cairan, perlu beberapa reaksi pencampuran. Beberapa memang berbahaya, tetapi sebaiknya kita menganggap semua cairan berbahaya (bisa diliat di MSDS/ material safety data sheet). Dalam melakukan SDS PAGE, selalu gunakan sarung tangan. Siapkan botol akuades dan tissue.

Enam Larutan Terpenting
1. Larutan A- Acrylamida/ Bis Solution
Mengandung: 7,3 gram akrilamida; 0,2 gram Bis (n,N-methylene-bis-acrylamide), akuades hingga 25 ml. Larutan disimpan dalam wadah yang dilapisi aluminium foil dan disimpan dalam kulkas 4°C. Larutan hanya boleh digunakan dalam kurum waktu 30 hari setelah pembuatan.

Bis berfungsi untuk cross link pemanjangan rantai polimer secara acak sehingga dihasilkan gel dengan sifat porosity yang bergantung pada kondisi polimerisasi dan konsentrasi monomer. Maka dari itu, pembuatan larutan A ini tidak memerlukan microwave.

2. N,N,N',N' - tetramethylethylenediamine (TEMED). 
Berperan mempercepat tingkat pembentukan radikal bebas dari persulfat (dengan kata lain katalis polimerisasi). Senyawa ini mudah teroksidasi dan kehilangan aktivitas katalitik yang ditandai dengan warna kuning.

3. Larutan E - 10% Ammonium persulfate 
contoh: 0,015 gram ammonium persulfate dalam 150 mikroliter akuades. Larutan ini dibuat sesaat sebelum digunakan. Harus fresh karena larutan ini bersifat radikal bebas sehingga tidak stabil, mudah bereaksi dengan oksigen dan rusak.

Peran ammonium persulfate adalah mengubah akrilamida monomer menjadi radikal bebas yang bereaksi dengan monomer yang tidak aktif untuk memulai reaksi rantai polimerisasi. Jika gel tidak berpolimerisasi, kemungkinan ammonium persulfat tidak ada. Ammonium persulfate umumnya akan hilang setelah beberapa hari pada suhu 4°C.

Bagaimana ketiga larutan ini bekerja?
Gel poliakrilamida terbentuk melalui kopolimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida. Polimerasi dimulai oleh ammonium persulfat dan TEMED. TEMED mempercepat tingkat pembentukan radikal bebas persulfat sehingga mengkatalis polimerisasi. Radikal bebas persulfat mengubah monomer akrilamida menjadi radikal bebas yang bereaksi dengan monomer yang tidak aktif untuk melakukan reaksi berantai polimerisasi.

Polimerisasi antar akrilamida terjadi saat ikatan rangkap akrilamida terbuka sehingga monomer akrilamida dapat bereaksi dengan akrilamida lain, menghasilkan molekul poliakrilamida yang linear. Pemanjangan ini kemudian di-cross link oleh Bis sehingga terbentuk gel dengan pori-pro yang didasarkan pada konsentrasi monomer dan kondisi polimerisasi.

Proses degass pada ketiga larutan (proses pengeluaran oksigen) dilakukan agar polimerisasi berjalan cepat atau tidak kontak dengan oksigen. Oksigen molekuler dapat menghambat polimerisasi dengan bereaksi dengan radikal bebas ion SO4- karena itu, PAGE gel dituang dalam tabung Falcon di suatu kondisi vakum, atau diantara plate secara vertikal, tidak horizontal seperti pada agarosa.

Pengaruh TEMED dan ammonium persulfat 
a. Berlebih

• Penurunan panjang rantai polimer 
• Peningkatkan turbiditas gel 
• Penurunan elastisitas gel 
• Gel tidak terpolimerisasi karena rantai polimer yang terlalu pendek sehingga tidak terjadi gelasi dan polimer tetap di larutan.  

b. Kurang

• Peningkatan rantai polimer
• Penurunan turbiditas 
• Peningkatan elastisitas 
• Karena konsentrasi rendah, oksigen lebih dulu masuk ke monomer dan menghambat polimerisasi sehingga gel menjadi sangat berpori dan lemah. 

Berapa range optimum? Untuk akrlimadi 5-12%, TEMED adalah 10 mikroliter dan 10% ammonium persulfat sebanyak 100 mikroliter. 

4. Larutan B - Larutan 1,5 M Tris HCl pH 8,8
Mengandung: 4,54 gram Tris (merupakan padatan). Atur pH hingga 8,8 baru dimasukan akuades hingga 25 ml. Larutan disterilisasi dengan autoklaf.

Larutan B berperan memberikan kondisi yang cocok untuk proses resolving gel pada pH 8,8. Dalam larutan ini, glisin (ditemukan di running buffer) terionisasi dan bermuatan negatif sehingga bergerak lebih dulu dari protein.

5. Larutan C - Larutan Tris HCl pH 6,8 
Mengandung 1,5 gram Tris, atur pH sampai 6,8 dengan HCl, baru dimasukkan akuades hingga 25 ml. Sterilisasi dengan autoklaf. Larutan C memberikan kondisi yang cocok untuk proses stacking. Pada larutan ini, glisin (ditemukan di running buffer) bermuatan netral sehingga bergerak dibelakang Cl- dan menyebabkan protein tertahan membentuk zona khusus.

*Cara penentuan pH larutan B dan C akan dibahas pada part II*

6. Larutan D - SDS/ Sodium Duodecyl Sulfate 
Mengandung: 2,5 gram SDS dalam 25 ml akuades.

SDS digunakan untuk denaturasi protein menjadi linear dan bermuatan negatif. SDS merupakan deterjen anionik 12 ekor karbon yang menempel dengan gugus sulfat. SDS berikatan non kovalen dengan protein dengan stoikiometri satu molekul SDS untuk dua asam amino. Denaturasi yang dilakukan oleh SDS hanya pada ikatan non kovalen (ikatan lemah) pada protein, untuk ikatan kovalen dan ikatan peptida tidak. Ikatan ini membuat protein menjadi linear dan kehilangan bentuk asalanya.

SDS menyebabkan protein bermuatan negatif. Muatan intrinsik protein tertutup oleh SDS sehingga selama proses SDS PAGE, semua protein bermigrasi menuju anoda dan memiliki rasio muatan per massa yang mirip dan bentuk yang mirip, hanya berat molekul yang berbeda.

* Mengapa ada istilah A, B, C, D, dan E? Ini adalah urutan dalam pembuatan larutan untuk mempersiapkan gel. Selain keenam larutan yang telah disebut, terdapat lima larutan lainnya yang digunakan untuk proses SDS PAGE.

Larutan lainnya:
1. Running Buffer (5 x)
Mengandung 15 gram Tris, 72 gram Glisin, 5 gram SDS, dan 1 L akuades

2. Sample Buffer
Mengandung 0,6 ml Tris HCl, 2,94 ml gliserol 85%, 2 ml SDS 10%, 0,5 ml 2-merkaptoetanol, 1,9 ml akuades, 0,01 gram bromophenol blue. Larutan diaduk dengan batang pengaduk dan disimpan pada suhu 4C.

Gliserol - digunakan untuk memberatkan protein sehingga semua protein masuk ke dasar well. 

2- merkaptoetanol, memiliki dua peran:

• merupakan reducing agent (agen pendisosiasi) yang menghilangkan struktur tertiary dan kuarternari yang tersisa dengan mengurangi ikatan disulfida intramolekular dan intermolekular. Jadi mengganggu cross link protein. Jika 2-merkaptoetanol tidak digunakan, protein akan menggulung dan tidak diketahui berat molekul protein tersebut.   
• mengurangi kerusakan oksidasi yang disebabkan residu protein.

2- merkaptoetanol tidak boleh berlebihan. Jika berlebihan akan membentuk cross link antara protein dan akrilamida sehingga gel menjadi smear. Agen ini juga dimasukkan terakhir agar tidak mempercepat break down bromophenol blue. 

Bromophenol blue/ front trailing dye

Memberikan warna pada protein sehingga dapat diketahui apakah proses SDS PAGE berjalan dengan baik atau sudah selesai. Bromophenol blue memiliki muatan sedikit negatif sehingga bergerak dalam arah yang sama dengan protein, tetapi tidak dapat berikatan dengan protein. Bromophenol blue yang yang membuat adanya garis-garis biru pada akhir gel. Garis biru ini sama sekali tidak mengandung protein. 

Syarat dari front trailing dye adalah: tidak berikatan dengan protein & bermuatan negatif 

3. Stain Solution
Pewarna yang dapat digunakan: coomasive blue, amido black, india ink, silver stain, colloidal gold, atau western blot. Coomasive blue dan silver stain adalah stain solution yang sering digunakan. Coomasive blue lebih sederhana dan murah sementara silver stain lebih bagus tetapi lebih berbahaya.

Silver stain merupakan dye yang 10-100 kali lebih sensitif dan digunakan untuk mendeteksi protein berjumlah rendah. Namun tidak digunakan untuk mengetahui konsentrasi protein. Walaupun terdapat perbedaan ketebalan pada band-nya, itu hanya efisiensi pewarnaan protein oleh silver stain

Coomasive blue
Mengandung: 0,25 gram coomasive blue, 112,5 ml metanol, 112,5 ml akuades. Aduk hingga merata, baru masukan 25 ml asam asetat glasial. Aduk rata dan simpan pada suhu ruang dan dengan tertutup rapat.

Coomasive blue adalah pewarna yang beriaktan erat pada hampir semua protien. Dalam solusi asam berwarna merah, bermuatan positif hingga pH 2. Ketika pH diatas 2, berubah warna menjadi biru dan bermuatan negatif.

Perubahan warna terjadi karena adanya pengikatan protein yang diuji. Bentuk merah coomasive mendonorkan elektron bebas untuk mengionisasi gugus protein, meyebabkan terganggungnya keadaan asal protein dan menunjukkan kantung hidrofobik protein. Kantung protein ini akan berikatan non kovalen dengan bagian non polar coomasive. Hal ini menyebabkan gugus amina positif protein berikatan dengan muatan negatif asam sulfonat coomasive. Ikatan diperkuat dengan ikatan ionik.

Dye akan berikatan dengan protein hingga semua muatan positif ternetralisasi atau semua dye berikatan dengan protein. Jika coomasive blue lebih banyak daripada protein, warna biru sebanding dengan konsentrasi protein (berbeda dengan silver stain)

Asam asetat diperlukan untuk memastikan protein tetap dalam gel dan mengendalikan penyusutan gel yang disebabkan oleh metanol.

4. Destain Solution
Mengandung 50 ml metanol, 50 ml asam asetat glasial, 400 ml akuades. Aduk larutan hingga merata dan simpan pada suhu ruang dengan tertutup rapat.

Destain solution berfungsi membilas coomasive blue yang tidak berikatan dengan protein. Coomasive blue tersebut akan berdifusi keluar dari gel.

5. Marker
Marker ada dua jenis:

• Molecular weight marker - menunjukan campuran protein asli yang ukuran dan mobilitasnya telah dikarakterisasi tetapi tidak sesuai dengan bilangan bulat. 
• Protein ladder - mengacu pada campuran protein yang di-prestain atau dilabel yang ukurannya sesuai dengan jumlah nilai keseluruhan. 

Unstained vs prestained
Unstained marker tidak dapat dilihat selama elektroforesis, sehingga harus diwarnai setelah proses. Contoh unstained marker yang digunakan adalah pageruler low range  unstained protein ladder FERMENTAS 

Mengandung tujuh protein 5 kDa-100kDa dan satu peptida sintesis 3,4 kDa. Marker ini dapat dilihat dengan coomasive blue/ silver stains. 25 kDa adalah berat molekul dengan intensitas protein tertinggi.

Prestained marker terlihat saat elektroforesis, sehingga tidak memerlukan pewarnaan. Marker ini memberikan cara yang mudah dan cepat untuk melihat efisiensi blooting dan monitoring separasi protein selama elektroforesis. Masih dapat terlihat saat gel di-staining. 

Dibandingkan dengan unstained marker, prestained protein marker kurang menunjukan ukuran protein secara presisi. Berat molekulnya sendiri lebih besar daripada unstained protein marker. Beberapa produk memiliki warna yang berbeda pada setiap band sehingga memberikan identifikasi band mana yang memiliki berat molekul apa secara mudah, walaupun mungkin beberapa band telah keluar dari gel.

Semoga artikel ini membantumu :)
Part II akan membahas prosedur dan mekanisme kerja SDS PAGE, see you soon!

Referensi: 
Catatan kuliah

Referensi foto: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_1658100.pdf