Instrumen #4: Rotary Evaporator

Rotary evaporator adalah salah satu alat umum yang digunakan di bioteknologi dan penelitian yang melibatkan pemekatan ekstrak. Sebagai murid S1, aku ngerti kenapa alat ini cukup menakutkan. Yuk kita bahas cara menggunakannya supaya kamu lebih nyaman memakai alat ini 

A. Apa itu Rotary Evaporator 

Rotary evaporator adalah alat evaporasi yang digunakan untuk memisahkan pelarut volatil dari senyawa bioaktif (ekstrak). Alat ini akan memanaskan campuran pada suhu rendah yang tercapai dengan menurunkan tekanan, dengan harapan dapat menguapkan pelarut saja tanpa merusak bioaktif. Nama rotary dari alat ini mengacu pada kondisi diputarkan labu pelarut untuk meningkatkan luas permukaan. Kondisi vakum pada alat ini juga akan menggerakan uap pelarut ke ruang kondensasi sehingga uap pelarut dapat diubah menjadi cairan yang ditampung di dalam labu pelarut. 

Tiga poin penting:

1. Kondisi vakum untuk menurunkan titik didih pelarut.
2. Perputaran/ rotary untuk meningkatkan luas permukaan ekstrak sehingga pemanasan terjadi merata.
3. Pemanasan untuk menguapkan pelarut pada titik didihnya tanpa mencapai titik didih bioaktif.  

B. Contoh Rotary Evaporator 

Bagian-bagian rotary evaporator. Sumber http://www.chem.ucalgary.ca/courses/351/laboratory/rotavap.pdf

Keterangan: 

1. Evaporation flask (labu evaporasi/ labu lemak) - tempat menampung ekstrak (pelarut + senyawa bioaktif) 
2. Manual lift knob control - mengatur ketinggian evaporator 
3. Flask clamp & remover - mengikat dan melepas labu evaporasi 
4. Rotation speed control - mengatur kecepatan perputaran labu evaporasi 
5. Power switch- menyalakan/ mematikan mesin 
6. Digital display of rotation speed -menunjukkan nilai rpm kecepatan perputaran. 
7. Cooling water inlet - jalur masuknya air bersuhu dingin (ada juga cooling water outlet, tempat keluarnya air dingin tersebut) 
8. Vacuum pipe - pipa untuk pompa vakum 
9. Vent hole - lubang untuk mengatur kondisi vakum (gunakan jari tangan untuk menutup) 
10. Stopcock - penutup ruang vakum untuk menghindari kebocoran. 
11. Condenser - tempat terjadinya kondensasi uap pelarut menjadi cairan 
12. Receiving flask (labu pelarut) - wadah penampung pelarut yang terkondensasi  
13. Thermostatic water bath - tempat air untuk memanaskan ekstrak ditampung 
14. Thermostat control - pengatur suhu air di water bath 
15. Feeder valve (seperti keran) - bagian terpisah, berupa keran yang digunakan untuk memasukkan campuran ekstrak lain ke dalam labu extrak. 

Feeder valve 
sumber: https://www.acrossinternational.com/Ai-2L-SolventVap-Rotary-Evaporator-Glass-Feeding-Tube-w-Valve-SE-FT-SE05.htm

Kondenser Vertikal dan Miring

Rotary evaporator punya model yang berbeda tergantung brand dan kode produknya. Ada tipe rotary evaporator dengan kondenser vertikal, tidak miring seperti pada gambar bagian-bagian rotary evaporator. Perbedaan fisik hanya pada bagian untuk memasukan feeder valve, terpisah dari condenser. 

Contoh rotary evaporator vertikal
sumber: dokumen pribadi

C. Cara melakukan evaporasi 

1. Persiapan Ekstrak 

1. Hasil ekstraksi disaring (bisa menggunakan kain saring biasa atau nibol 365) untuk memisahkan ampas dengan larutan ekstrak. 
2. Sisa ampas lembut yang masih tertinggal di dalam ekstrak dapat disaring dengan Whatman 4 dan Whatman 1. 
3. Simpan di botol gelap atau botol yang dilapisi aluminium foil. Tutup rapat agar kedap udara. Simpan di lemari es, jika tidak akan segera melakukan evaporasi. 
4. Sebaiknya evaporasi dilakukan di hari yang sama dengan pengambilan hasil ekstrak. Lebih dari satu minggu, kemampuan bioaktif (terutama antioksidan akan menurun sekitar 2x lipat) 

2. Persiapan Rotary Evaporator 

Walau kamu tahu tidak ada yang menggunakan rotary evaporator sebelum kamu, tetap lebih baik membersihkan rotary evaporator untuk menghindari kontaminasi ekstrak. 

a. Membersihkan labu dan stopcock:

1. Lepaskan stopcock (knop vakum), cuci bersih dan pasang lagi. Jangan lupa lumuri vaselin untuk mengurangi celah udara. 
2. Labu pelarut dan labu extrak dibilas dengan etanol 96%, minimal dua kali 

Pencucian labu dengan aseton (atau sabun dan air, tradisional-nya) dapat diperlukan apabila labu kotor. 

b. Untuk membersihkan kondensor: 

1. Isi labu ekstrak (lebih baik ukuran kecil) dengan etanol 96% atau pelarut yang akan kamu gunakan. 
2. Pasang labu ekstrak dan labu pelarut. Lalu nyalakan mesin vakum. 
3. Cek vent hole dan pastikan dalam keadaan terbuka. Letakan jari pada lubang vent hole. 
4. Tunggu hingga pelarut mengalami bumping. Pada kondisi ini kamu bisa setting suhu dan rpm yang cukup untuk membuat pelarut mengalami bumping. 
5. Lepaskan jari dari lubang pada saat pelarut bumping dan masuk ke kondensor. 
6. Lakukan beberapa kali, buang pelarut yang masuk ke labu pelarut. Bilas labu kembali dan evaporator bisa digunakan. 

Ada cara lain yang bisa digunakan. Tetapi cara ini harus hati-hati dan sebaiknya ditemani mentor/ asisten lab. Tidak boleh dilakukan terburu-buru karena potensi labu pecah: 

1. Isi labu ekstrak dengan etanol 96% atau pelarut yang kamu gunakan. Pasang labu ekstrak dan labu pelarut. Lalu nyalakan mesin vakum 
2. Cek vent hole. Pastikan tertutup.
3. Tunggu hingga jarum vakum berada sekitar 50%. 
4. Tarik perlahan labu ekstrak untuk menyebabkan bumping yang akan membilas tabung kondensor. 
5. Lakukan beberapa kali, buang pelarut yang masuk ke labu pelarut, bilas labu kembali, dan evaporator siap digunakan. 

Memang agak berbahaya, Kalau tidak hati-hati, labu ekstrak bisa terantuk pinggir water bath dan pecah. Ada juga yang berpendapat bahwa cara ini dapat merusak mesin vakum, tetapi ada juga orang yang menggunakan cara ini. 

Kalau kamu takut, cara pertama lebih baik. Atau ya lebih baik kamu selalu melakukan evaporasi secara apik sehingga apparatus tidak kotor dan harus dibersihkan. Proses pembersihannya sangat susah. 

c. Pengecekan waterbath 

Air yang digunakan tidak boleh air keran, harus air distilasi. Hal ini untuk mencegah pembentukan kerak putih pada water bath. Tidak memengaruhi proses evaporasi, tapi kamu sama aja tidak bisa jaga barang dengan baik. 

1. Pastikan volume air dalam water bath cukup menutupi semua permukaan labu ekstrak yang berisi pelarut ekstrak. 
2. Pengisian tidak boleh terlalu banyak, mengingat nanti ada labu yang dimasukan yang akan meningkatkan ketinggian air. 
3. Setelah melakukan evaporasi, air water bath tidak boleh ditinggal. Hal ini bisa menyebabkan karat. 
4. Simpan air dalam botol sendiri (lebih baik galon kecil) untuk sewaktu-waktu dapat digunakan kembali. 

d. Perakitan Rotary Evaporator 

1. Hasil maserasi yang telah difilter, dimasukan ke dalam labu ekstrak. Volume harus kurang dari setengah labu. Mengingat posisi labu akan miring, jarak antar larutan ekstrak dan tabung depan kondensor menjadi lebih dekat.  
2. Pasang labu ekstrak dan labu pelarut. Jika diperlukan, gunakan vaselin pada pertemuan tabung kondensor dan kedua labu (kalau clamp sudah kuat, tidak perlu sih).

Pada saat vakum dinyalakan nanti, pertemuan labu dan tabung kondensor akan lebih kuat. Tetapi jangan karena kondisi ini, pemasangan labu dan clamp sengaja menjadi longgar. Sangat berbahaya apabila vakum dimatikan. 

3. Menyalakan apparatus

1. Nyalakan chiller (mesin pendingin) dan tunggu hingga suhu yang diperbolehkan. Biasanya memerlukan waktu, jadi bisa kamu gunakan untuk mempersiapkan peralatan yang lain. Letakan tangan pada kondensor untuk mengetahui suhu. 
2. Nyalakan penghangat water bath dan set pada suhu yang diinginkan (biasanya untuk ekstrak, rentang suhu adalah 40-50C).
3. Lalu nyalakan vakum. Lihat petunjuk tekanan dan pelarut. Setiap pelarut memiliki anjuran tekanan-nya sendiri. Atur tekanan pada sekrup mesin vakum (setiap mesin memiliki alat kontrol yang berbeda).
4. Turunkan labu ekstrak hingga semua larutan ekstrak tertutup batas air water bath.
5. Set kecepatan perputaran (biasanya 60-80 rpm). Suhu dan rpm ditentukan kembali dari sifat senyawa yang akan diambil. Sebisa mungkin pada suhu dan rpm minimum untuk menghindari bumping.

4. Mengatasi bumping:

1. Bumping larutan ekstrak bisa dicek dengan meletakan jari pada vent hole. 
2. Lepaskan pada saat terjadi bumping. Pelepasan ini membuat udara masuk dan ruang apparatus tidak vakum dan mendorong larutan kembali ke labu ekstrak, sehingga mencegah bumping. 
3. Lakukan berkali-kali hingga ekstrak tidak bergelembung lagi. 
4. Tutup vent hole dengan memutar stopcock. Jika terjadi gelembung lagi, putar kembali stopcock ke posisi vent hole terbuka. 

Cara ini juga bisa dilakukan untuk ekstrak yang tetap mengalami bumping pada suhu dan rpm minimum, terutama ekstrak yang mengandung saponin tinggi (teh misalkan).  

5. Saat evaporasi 

Waktu yang diperlukan untuk melakukan evaporasi berbeda untuk setiap pelarut. Dari pengalaman, hexana lebih cepat daripada etil asetat dan etanol. Tapi tidak berarti pelarut nonpolar akan selalu lebih cepat. Selain tekanan dan titik didih, lama waktu evaporasi juga dipengaruhi lagi oleh volume total larutan ekstrak dan sifat volatil mereka.

Evaporasi dinyatakan selesai apabila larutan ekstrak menjadi kental. Lebih baik larutan ekstrak masih mengandung sedikit pelarut daripada benar-benar kering. Kondisi ini memudahkan kamu mengeluarkan ekstrak dari labu ekstrak. 

Nah kan, yang bagian kering ini yang nanti susah diambil, sekalipun dibilas dengan pelarutnya
sumber: dokumen pribadi

6. Mematikan apparatus 

1. Kembalikan suhu pada titik nol, kembalikan rpm pada nilai nol, dan naikkan ketinggian evaporator. 
2. Pegang labu ekstrak dengan tangan kanan dan putar stopcock dengan tangan kiri. Hanya pada saat vakum sudah dilepaskan, labu ekstrak dapat dikeluarkan.
3. Cara lain bisa dengan melonggarkan sekrup pengontrol vakum pada mesin vakum. Setelah jarum vakum mencapai titik nol, longgarkan stopcock sambil tetap memegang labu ekstrak. 
4. Longgarkan knop untuk melepas labu ekstrak.
5. Longgarkan knop untuk melepas labu pelarut. Tuang labu pelarut dalam wadah yang sudah disediakan. Pelarut ini dapat digunakan untuk ekstraksi lagi, tetapi tidak untuk melarutkan ekstrak crude. 
6. Matikan mesin vakum dan chiller. 
7. Tuang ekstrak dari labu ekstrak ke wadah coklat/ berlapis aluminium foil. Sisa ekstrak yang tidak tertuang dapat dibilas dengan sedikit pelarut dan digabung dengan wadah tadi.
8. Bilas kedua labu dan cuci seperti biasa. 

7. Langkah terakhir 

Setelah ekstrak pekat diperoleh, kamu harus menentukan apakah akan membuat ekstrak padat atau kental. Ada dua cara yang biasanya digunakan: 

a. Menggunakan nitrogen

1. Ekstrak yang dihasilkan bisa padat bisa kental, tapi umumnya kental. 
2. Simpan ekstrak pada botol gelap. Gas nitrogen disemprotkan pada ekstrak hingga volume larutan lebih berkurang. 
3. Hati-hati dalam mengatur tekanan nitrogen. Terlalu tinggi dapat membuat ekstrak muncrat kemana-mana dan pipa nitrogen bisa tidak terkontrol dan menampar kamu. 
4. Simpan ekstrak dalam botol tersebut dan lapisi dengan aluminium foil. 
5. Cocok untuk ekstrak thermolabile. 

b. Menggunakan oven

1. Ekstrak yang dihasilkan bisa padat dan kamu tidak perlu berada di tempat. 
2. Tuang ekstrak pada cawan penguapan dan masukan ke dalam oven . Pastikan diletakan pada bagian bawah oven agar penguapan terjadi lebih cepat (asalkan tidak ada barang basah di atasnya). 
3. Ekstrak bisa digerus menjadi bubuk, atau disimpan dalam keadaan pekat di cawan penguapan. Selalu lapisi dengan aluminium foil. 
4. Hanya untuk ekstrak yang thermostabile.    

PS: oven ya bukan inkubator. Perbedaan keduanya terletak pada apakah di dalam suatu "kotak hangat" tersebut punya lubang pada bagian atasnya sebagai tempat uap air keluar. Jika tidak ada, kemungkinan besar inkubator. Jangan sekali-kali memasukan ekstrak ke dalam inkubator. Inkubator hanya untuk mikroba. 

Mengapa banyak yang takut menggunakan rotary evaporator? Harganya mahal :(

Jadi benar-benar harus hati-hati menggunakannya. Kalau kamu baru pertama kali lebih baik didampingi daripada bayar ganti. 

Semoga artikel ini membantumu 

Referensi: 

Pengalaman kuliah pribadi 

Referensi cover: https://www.labx.com/product/buchi-r-210-for-sale