Pewarnaan Bakteri #2: Endospore Staining

Tidak hanya pewarnaan diferensial Gram stain, untuk mewarnai bakteri digunakan metode pewarnaan endospora atau metode Schaeffer-Fulton untuk mewarnai endospora. Apa itu endospora? Apa fungsi dengan pewarnaan ini dengan ditemukannya endospora?

Lihat lagi artikel mengenai bioteknologi (klik judul)

Apa itu endospora?

Endospora adalah struktur dorman yang tidak melakukan metabolisme. Endospora dihasilkan bakteri saat lingkungan ekstrim. Endospora berbentuk oval atau silindris, sangat padat, dan refraktil. Endospora memiliki letak yang berbeda pada setiap bakteri, ada yang di tengah, ujung, atau mendekati ujung tubuh bakteri. Bahkan dapat ditemukan endospora di luar tubuh sel vegetatif. Ketika lingkungan sudah memungkinkan, endospora akan berkembang menjadi sel vegetatif. 

sumber: quizlet.com

Metode

Persiapan

Kultur yang digunakan harus berumur satu minggu sehingga mengandung sel vegetatif dan endospora yang cukup. 

1. Semprotkan etanol 70% pada kaca benda dan keringkan dengan tisu kering. 
2. Berikan satu tetes air pada kaca benda/
3. Dengan tusuk gigi, letakan mikroorganisme pada kaca objek secara aseptis dan aduk. 
4. Preparat dibiarkan mengering hingga terbentuk lapisan tipis (bisa menggunakan hair dryer). 

Pewarnaan

1. Teteskan malachite green pada lapisan tipis. Hati-hati, malachite green bersifat KARSINOGENIK.
2. Kaca objek dipanaskan selama lima menit di atas gelas beaker berisi air panas yang tidak terlalu mendidih. Jika permukaan mengering, teteskan malachite green lagi. 
3. Bilas kaca objek dengan air mengalir dan tetesi safranin hingga menutuppi seluruh permukaan lapisan tipis. Biarkan satu menit 
4. Bilas dengan air mengalir dan keringkan (bisa menggunakna hair dryer).

Pengamatan

1. Mulailah pengamatan di bawah mikroskop dengan kekuatan lensa terendah.
2. Saat mengamati dengan lensa perbesaran total 1000X, gunakan minyak imersi.

Science Fact, How does it happen that way?

sumber: www.microbiology.com

Endospora akan terlihat bulat hijau di dalam atau di luar sel vegetatif yang berwarna merah. Dari metode ini, kita dapat mengetahui bakteri yang menghasilkan endospora atau tidak. Lalu, bagaimana hal ini dapat terjadi? 

Pewarna primer 

Malachite green adalah reagen basa sehingga dapat berikatan dengan komponen negatif endospora dan sel vegetatif. 

Pada kondisi ini:

sel vegetatif = hijau

endospora = sedikit/belum hijau 

Pemanasan sebagai mordan 

Namun, karena endospora memiliki lapisan yang terdiri dari keratin, protein, dan kalsium sehingga menahan masuknya reagen pewarna. Oleh karena itu diperlukan pemanasan. Pemanasan membuat dinding endospora permeable terhadap malachite green. Malachite green yang masuk akan melekat pada peptidoglikan endospora. Setelah pemanasan, dinding endospora kembali semula sehingga malachite green tidak keluar dari endospora. 

Penetesan saat permukaan kering dilakukan agar permukaan tetap basah sehingga malachite green lebih terserap dan melekat pada peptidoglikan. 

Pada kondisi ini:

sel vegetatif = berwarna hijau

endospora = berwarna hijau

Pembilasan air sebagai decolorasi

Karena ikatan antara malachite green dan sel vegetatif lemah, malachite green akan larut terbawa air pada saat pembilasan, membuat sel vegetatif tidak berwarna. Dinding endospora yang telah kembali bersifat impermeable menghalangi malachite green dalam endospora untuk ikut terbawa air. 

Pada kondisi ini: 

sel vegetatif = kehilangan warna hijau

endospora = berwarna hijau

Safranin

Safranin juga adalah counterstain yang akan memberikan warna merah pada sel vegetatif. Karena sel telah kehilangan warna, safranin akan masuk dan berikatan dengan komponen negatif sel vegetatif. Namun, safranin tidak dapat menembus dinding endospora yang impermeable. 

Pada kondisi ini:

sel vegetatif = berwarna merah

endospora = berwarna hijau 

A: Escherichia coli (tidak menghasilkan endospora); B: Bacilus subtilis (menghasikan endospora)
sumber: dokumen pribadi

Memang tidak terlihat endospora secara jelas pada B. subtilis karena kultur baru berumur 24 jam. Untuk kultur dengan endospora yang cukup banyak akan terlihat seperti ini:

hijau: endospora; merah: sel vegetatif
sumber: www.austincc.edu

Semoga artikel ini membantumu :)

Lihat lagi artikel mengenai bioteknologi (klik judul)

Special thanks: 

Danish A.

D. Juvi

Elbert H.

Jeff S.

M. Nova

Referensi:

Austin Community College. 2007. Endospore Stain. Retrieved from Microbugz: http://www.austincc.edu/microbugz/endospore_stain.php (15 Mei 2015).

Rossbach, S. 2001. Endospore Stain Results. Retrieved from Western Michigan: https://homepages.wmich.edu/~rossbach/bios312/LabProcedures/Endosproe_stain_results.html (15 Mei 2015).

Reynolds, J. 2011. The Endospore Stains. Retrieved from Dallas County Community College District: http://delrio.dcccd.edu/jreynolds/microbiology/2421/lab_manual/spore_stain.pdf (15 Mei 2015).

Portland Community College. 2012. The Standard Endospore Stain. Retrieved from Portland Community College: http://spot.pcc.edu/~jvolpe/b/bi234/lab/differentialTests/endospore_stain.htm (15 Mei 2015).

Cornell University. 2015. Bacterial Endospores. Retrieved from Cornell University: https://micro.cornell.edu/research/epulopiscium/bacterial-endospores (16 Mei 2015).

Brandon, L. Differential Staining: The Endospore Stain. Retrieved from Mississippi University for Women:  http://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=3&cad=rja&uact=8&ved=0CC8QFjAC&url=http%3A%2F%2Fwww2.muw.edu%2F~lbrandon%2FMicro%2Fendospore.doc&ei=u51VVeySENGxuATN44C4Cw&usg=AFQjCNEIj5aDn0otGTxhKgjG_ajCSLNWDA&sig2=u1qiAht3K8iWp_8X7UnPMg (15 Mei 2015).