Pewarnaan Bakteri #1: Gram Stain / Pewarnaan Gram

Bakteri berperan dalam pembentukan penyakit kulit, penghasil metabolit yang dapat digunakan sebagai "obat", hingga merusak produk make up. Untuk itu, para penelti mempelajari karakteristik bakteri, termasuk morfologi bakteri. Morfologinya dapat dilihat dari mikroskop, tetapi tidak semua bakteri akan terlihat karena umumnya di bawah mikroskop, bakteri akan terlihat transparan. Untuk itu diperlukan metode pewarnaan. Apa saja metode yang digunakan? 

Lihat lagi artikel mengenai bioteknologi (klik judul)

Salah satu metode pewarnaan adalah Gram stain yang ditemukan oleh ahli bakteriologi Denmark, Hans C. J. Gram pada tahun 1882. Gram stain adalah metode pewarnaan diferensial karena menggunakan lebih dari satu reagen warna. 

Metode 

Persiapan

1.  Semprot kaca objek dengan etanol 70% dan keringkan dengan tisu.
2.  Beri satu tetes air pada kaca objek.
3. Gunakan tusuk gigi untuk mengambil koloni bakteri dan pindahkan pada kaca objek. Lakukan hal ini secara aseptik (lingkungan tempat operasi harus steril).
4. Tunggu kering (bisa menggunakan hair dryer) hingga membentuk lapisan tipis.  
5. Fiksasi dengan melewatkan kaca objek pada api.

Fiksasi
sumber: dokumen pribadi

Pewarnaan 

1. Teteskan kristal violet hingga menutupi permukaan lapisan tipis. Tunggu satu menit
2. Bilas dengan air mengalir. 
3. Teteskan iodin hingga menutupi permukaan lapisan tipis. Tunggu satu menit 
4. Bilas dengan air mengalir.
5. Teteskan decolorant (etanol 96%) hingga warna ungu kristal violet hilang. 
6. Bilas dengan air mengalir.
7. Teteskan safranin dan biarkan selama satu menit. 
8. Bilas dengan air mengalir dan biarkan mengering (bisa menggunakan hair dryer). 

Penetesan kristal violet
sumber: dokumen pribadi

Pengamatan

1. Kaca objek bisa langsung diamati di bawah mikroskop.
2. Gunakan lensa dengan perbesaran terkecil ke terbesar. 
3. Saat mengamati dengan perbesaran lensa total 1000X, gunakan minyak imersi.

Science Fact, How does it happen that way?

Hasil dari pewarnaan akan memberikan warna ungu pada bakteri Gram-positif atau warna merah pada bakteri Gram-negatif. Ungu dan merah ditentukan dari susunan dinding sel bakteri. Jika bakteri memiliki peptidoglikan yang tebal, bakteri akan berwarna ungu, dan sebaliknya. Mengapa hal ini bisa terjadi? Lihat dulu perbedaan susunan dinding sel kedua bakteri.

Peptidoglikan bakteri Gram-negatif lebih tipis daripada peptidoglikan bakter Gram-positif
sumber: www.dreamstime.com

Apa itu peptidoglikan?
Peptidoglikan adalah polisakarida yang terdiri dari subunit N-asetil glukosamin dan asan N-asetil muramat yang dihubungkan oleh ikatan pendek peptida. Peptidoglikan menentukan bentuk sel dan membuat dinding sel kaku. Peptidoglikan yang tebal memampukan bakteri Gram-positif mempertahankan kompleks kristal violet-iodin sehingga sel bakteri berwarna ungu.

Apa hubungannya dengan pewarna yang digunakan?

sumber: fyeahmedlab.tumblr.com

Kristal violet

Merupakan reagen basa. Saat larut dalam air, kristal vilet terdisosiasi menjadi ion kristal violet bermuatan positif dan ion klorida bermuatan negatif. Kedua ion akan melewati dinding dan membran sel bakteri. Ion kristal violet akan berikatan dengan komponen negatif pada sel bakteri sehingga berwarna ungu. 

Pada kondisi ini:

bakteri Gram-negatif = berwarna ungu

bakteri Gram-positif = berwarna ungu 

Iodin

Iodin bekerja sebagai mordan, agen perangkap. Iodin berikatan dengan kristal violet menjadi kompleks kristal violet-iodin. Iodin akan meningkatkan afinitas dinding sel bakteri terhadap pewarna. Jadi kompleks kristal violet-iodin dapat berikatan dengan dinding sel. 

Pada kondisi ini:

bakteri Gram-negatif = masih berwarna ungu

bakteri Gram-positif = masih berwarna ungu 

Decolorant

Decolorant bertujuan memberikan kontras antara kedua jenis bakteri dengan menghapus warna ungu pada bakteri. Etanol 96%, contoh dari decolorant, akan melarutkan membran lipid (outer membrane) dari bakteri Gram-negatif sehingga lapisan peptidoglikan yang tipis terekspos dan kompleks kristal violet-iodin akan keluar. 

Tapi pada bakteri Gram-positif, etanol akan mendehidrasi dinding sel, menyebabkan pori-pori dinding sel mengerut. Hal ini membuat kompleks kristal violet-iodin tidak keluar. 

Pada kondisi ini: 

bakteri Gram-negatif = sedikit berwarna ungu

bakteri Gram-positif = berwarna ungu

Ingat: Jangan terlalu banyak atau sedikit meneteskan decolorant. Hal ini bisa menyebabkan bakteri Gram-positif akan terlihat sebagai Gram-negatif atau bakteri Gram-negatif akan terlihat sebagai Gram-positif. 

Safranin 

Safranin adalah pewarna counterstain. Safranin addalah reagen basa bermuatan positif yang akan berikatan dengan muatan negatif sel bakteri. Karena telah kehilangan warna ungu, bakteri Gram-negatif akan berikatan dengan safranin dan berwarna merah. Tapi bakteri Gram-positif tetap berwarna ungu karena warna safranin tidak dapat masuk, terhalang oleh adanya kompleks kristal violet-iodin. 

Pada kondisi ini:

bakteri Gram-negatif = akhirnya berwarna merah

bakteri Gram-positif = berwarna ungu 

A: Escherichia coli (Gram-negatif); B: Bacillus subtilis (Gram-positif)
sumber: dokumen pribadi

Selain metode ini ada juga metode pewarnaan endospora dan pewarnaan sederhana yang dibahas pada artikel lain. 

Semoga artikel ini membantumu :) 

Lihat lagi artikel mengenai bioteknologi (klik judul)

Special thanks:

Danish A.

D. Juvi

Elbert H.

Jeff S.

M. Nova 

Referensi:

Healthcare-associated Infections. 2011. Gram-negative Bacteria Infections in Healthcare Settings. Retrieved from Center for Disease Control and Prevention:  http://www.cdc.gov/hai/organisms/gram-negative-bacteria.html (16 Mei 2015).

Austin Community College. 2015. Gram Stain. Retrieved from Microbugz:  http://www.austincc.edu/microbugz/gram_stain.php (16 Mei 2015).

Sutton, S. 2011. The Gram Satin. Retrieved from Microbiology Network: http://www.microbiol.org/resources/monographswhite-papers/the-gram-stain/ (16 Mei 2015).

Media Lab Incorporated. 2011. Gram-stained Information and Courses from MediaLab, Inc. Retrieved from MediaLab:  https://www.medialabinc.net/gram-stained-keyword.aspx (16 Mei 2015).

Creighton University School of Medicine. 2015. Gram-Positive Bacteria. Retrieved from Creighton University School of Medicine: http://medschool.creighton.edu/fileadmin/user/medicine/MMI/Files/Bacteria_Table.pdf (15 Mei 2015).

Hillsborough Community College. 2014. Differential Staining: The Gram Stain. Retrieved from Hillsborough Community College:  http://www.hccfl.edu/media/568172/9-exercise%20vi.pdf (15 Mei 2015).

University of Colorado Boulder. 2006. The Gram Stain. Retrieved from Biological Sciences Initiative: http://www.colorado.edu/Outreach/BSI/pdfs/gramstain.pdf (15 Mei 2015).

Amrita University. 2015. Gram Stain Technique (Theory). Retrieved from Virtual Amrita Laboratories Universalizing Education:  http://vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=73&sim=208&cnt=1 (15 Mei 2015).

Bruckner, M. Z. 2012. Gram Staining. Retrieved from Microbial Life Educational Resources:  http://serc.carleton.edu/microbelife/research_methods/microscopy/gramstain.html (15 Mei 2015).

Amrita University. 2015. Gram Stain Technique (Procedure). Retrieved from Virtual Amrita Laboratories Universalizing Education:  http://vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=73&sim=208&cnt=2 (15 Mei 2015).